COPD人肺成纖維細胞IL-6、IL-8、彈性蛋白的生成及其炎癥調節(jié)的研究.pdf

1、[目的]
　　成纖維細胞是肺的重要結構細胞，并在肺組織破壞后的修復和/或重構中起著重要作用。近年來認為成纖維細胞也參與炎癥反應，例如成纖維細胞在風濕性關節(jié)炎等疾病中參與局部炎癥反應網絡的調控。目前關于肺成纖維細胞炎癥反應和修復功能關系的相關研究較少。為此，本研究擬評價慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺成纖維細胞炎癥因子水平、增殖能力和彈性蛋白合成的情況；在此基礎上深入探討脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、凋亡細胞、

2、壞死細胞等常見炎癥刺激對人肺成纖維細胞分泌細胞因子和增殖功能的影響，并觀察低劑量茶堿的調節(jié)作用。
　　[方法]
　　(1)從因肺癌等手術切除標本的正常肺組織中分離培養(yǎng)原代人肺成纖維細胞，建立細胞株庫，取第2、3代細胞進行進一步實驗和檢測。所有組織及其應用按照倫理學要求獲取知情同意簽字后實施。根據術前肺功能將研究對象分為非COPD、COPDⅠ～Ⅲ級。通過對照研究評價COPD患者肺成纖維細胞白介素(IL)-6和IL-8的mRNA

3、和蛋白水平、增殖能力以及彈性蛋白合成。
　　(2)將人肺成纖維細胞分別和1μg/ml LPS、1ng/ml TNF-α、凋亡細胞或壞死細胞共培養(yǎng)24h后收集培養(yǎng)液上清，并裂解細胞提取RNA保存?zhèn)錅y。
　　(3)在人肺成纖維細胞培養(yǎng)中加入凋亡細胞或壞死細胞，通過多重免疫熒光染色共聚焦顯像分析肺成纖維細胞的吞噬功能。
　　(4)采用逆轉錄實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測IL-6、IL-8、組蛋白去乙酰基酶2(HD

4、AC2)和彈性蛋白的mRNA轉錄水平。
　　(5)使用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定細胞培養(yǎng)液上清中的TNF-α、IL-6、轉化生長因子(TGF)-β1、TGF-β2、TGF-β3、IL-8、IL-12p70、IL-1β以及IL-10。
　　(6)使用Fastin Elastin Assay定量檢測彈性蛋白濃度。
　　(7)用AlamarBlue()(AB)法檢測LPS、TNF-α、IL-8、IL-6以及經LPS預處

5、理的巨噬細胞條件培養(yǎng)液對人肺成纖維細胞增殖的影響。
　　(8)檢測低劑量茶堿(5μg/ml)對LPS引起的肺成纖維細胞IL-6、IL-8分泌、HDAC2 mRNA轉錄以及增殖能力的影響。
　　(9)用GraphPad Prism5.0 for Windows進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的數據以平均值±標準差表示；未通過正態(tài)分布檢驗的數據以中位數(最小值，最大值)表示，其中部分增殖實驗結果以中位數(25％四分位數，75％四分位

6、數)表示。根據是否正態(tài)分布以及統(tǒng)計分析類型選擇相應的統(tǒng)計學方法。P<0.05為有顯著性差異。
　　[結果]
　　(1)分離得到的原代細胞在顯微鏡下具有成纖維細胞的典型形態(tài)，細胞免疫熒光染色顯示99％以上的細胞表達波形蛋白；而細胞角蛋白、von Willebrand因子、結蛋白染色陰性則證明無上皮細胞、間皮細胞、內皮細胞或平滑肌細胞混雜，說明原代分離的人肺成纖維細胞純度高。
　　(2)在COPD人肺成纖維細胞研究部分，根

7、據肺功能情況分為COPD s組(包括GOLDⅡ、Ⅲ級)和對照組(包括非COPD和GOLDⅠ級)，兩組在年齡、性別、吸煙史方面無顯著性差異。COPDs組(12例)和對照組(10例)FEV1占預計值％分別為(59.8±9.5)％和(92.3±8.4)％，FEV1/FVC％分別為(54.9±8.3)％和(73.6±10.8)％，P值均<0.001。
　　(3)qRT-PCR顯示COPDs組人肺成纖維細胞IL-6和IL-8的mRNA轉錄均

8、顯著高于對照組，與之相對應的，其蛋白分泌量也明顯升高，分別為(701.6±288.0)pg/ml vs(355.7±330.8)pg/ml(P=0.02)和(754.3±297.4)pg/ml vs(373.4±243.1)pg/ml(P=0.02)。IL-6、IL-8的轉錄及分泌水平和FEV1占預計值％和FEV1/FVC％均呈負相關。
　　(4)COPDs組人肺成纖維細胞體外增殖能力弱于對照組(1.18±0.32 vs1.63±

9、0.22，P=0.004)。
　　(5)COPDs組人肺成纖維細胞彈性蛋白mRNA代償性表達升高[6.194(3.118，33.000)vs2.241(0.916，22.140)，P=0.0276]，伴隨可溶性彈性蛋白升高[(26.40±6.50)μg/ml vs(15.00±3.90)μg/ml，P=0.001)]，但是不可溶性彈性蛋白無差別。
　　(6)在1μg/ml LPS刺激24h后人肺成纖維細胞分泌IL-6的水平從

10、(1156±455)pg/ml上升至(1535±439)pg/ml(P=0.0046)；IL-8從(510.5±170.6)pg/ml上升至(856.5±418.8)pg/ml(P=0.0122)；TGF-β1從(1188±623)pg/ml上升至(1773±847)pg/ml(P=0.0038)。IL-1β、TNF-α、IL-12p70、IL-10和TGF-β2基礎分泌較低，TGF-β3測不到；其中TGF-β2有較大幅度上升(P=0.

11、0274)，IL-1β有小幅度升高(P=0.0027)，IL-10從(37.6±17.9)pg/ml下降至(25.1±7.5)pg/ml(P=0.0382)，而TNF-α和IL-12p70則基本無改變。
　　(7)加入1ng/ml TNF-α培養(yǎng)24h后體外人肺成纖維細胞也出現了和LPS刺激相仿的反應，其中以IL-8上升尤為明顯，具體表現為IL-6從(1066±305)pg/ml上升至(1398±466)pg/ml(P=0.035

12、8)、IL-8從(532.3±71.7)pg/ml上升至(1660.0±389.2)pg/ml(P=0.0009)、TGF-β1從(218.9±32.6)pg/ml上升至(247.9±29.4)pg/ml(P=0.0495)。
　　(8)qRT-PCR結果顯示HDAC2 mRNA在人肺成纖維細胞的相對表達量在LPS刺激后從3.546(0.511，8.886)下降至1.793(0.174，3.284)(P=0.0355)；TNF-α

13、刺激后HDAC2 mRNA表達略下降，從1.057(0.090，8.886)至0.933(0.073，2.965)，但無顯著性差異(P=0.0625)。
　　(9)人肺成纖維細胞具有吞噬周圍的凋亡細胞和壞死細胞的能力，并在和凋亡細胞接觸24h后IL-6從(991.9±463.8)pg/ml上升至(1616.0±216.5)pg/ml(P<0.01)。和壞死細胞共培養(yǎng)24h后，則出現IL-8從(371.5±57.74)pg/ml上升

14、至(740.0±204.7)pg/ml(P<0.01)；IL-1β和IL-10基礎分泌水平較低，前者上升，而后者有下降，P值均小于0.05。
　　(10)LPS共培養(yǎng)48h對人肺成纖維細胞的增殖有抑制作用，并且這種抑制作用隨著濃度和時間的增加而增加。當濃度達到0.1μg/ml時，抑制幅度為4％左右(P=0.0306)；濃度為1μg/ml時抑制幅度約為8％(P=0.0112)；作用時間達到24h時抑制作用開始具有顯著性差異。TNF-

15、α對體外人肺成纖維細胞的增殖功能的抑制作用有劑量依賴效應，10ng/ml時抑制程度約為10％(P=0.0241)；IL-8和IL-6具有相似效應。經LPS預處理的巨噬細胞條件培養(yǎng)液對人肺成纖維細胞的增殖能力有抑制作用(P<0.05)。
　　(11)在低劑量茶堿作用研究部分，IL-6從無干預對照組的(1150±426)pg/ml上升至LPS組的(1559±406)pg/ml(P<0.001)；而茶堿+LPS組為(1336+400)p

16、g/ml，較LPS組低(P<0.05)。IL-8的趨勢和IL-6相似，空白對照組、LPS組、茶堿+LPS組分別為(560±205)pg/ml、(1087±359)pg/ml和(933±338)pg/ml。但是5μg/ml茶堿不影響細胞的HDAC2 mRNA水平，對1μg/ml LPS引起的HDAC2 mRNA下調也無作用。在0.1～10μg/ml的濃度范圍內茶堿對人肺成纖維細胞的增殖能力無影響，而在LPS刺激的同時加入5μg/ml茶堿可

17、以改善LPS導致的細胞增殖抑制(P<0.05)。
　　[結論]
　　(1)COPD患者肺成纖維細胞IL-6和IL-8的合成分泌上調，其水平和肺功能呈負相關；伴隨著細胞增殖功能受損以及可溶性彈性蛋白向不可溶性彈性蛋白轉化的障礙，說明人肺成纖維細胞參與COPD的炎癥反應，同時修復功能受損。
　　(2)在受到LPS和TNF-α刺激后，體外人肺成纖維細胞出現以IL-6、IL-8、TGF-β1升高為特征的改變；人肺成纖維細胞能夠

18、吞噬凋亡細胞和壞死細胞，并釋放不同的細胞因子，前者以IL-6分泌上升為主，而后者表現為IL-8、IL-1β上升、IL-10下調，這提示人肺成纖維細胞可以隨著局部環(huán)境的變化釋放不同的細胞因子從而參與炎癥反應的調節(jié)。LPS引起的細胞因子釋放和HDAC2轉錄下調有關。
　　(3)LPS、TNF-α、IL-6、IL-8以及經LPS預處理的巨噬細胞條件培養(yǎng)液對人肺成纖維細胞增殖功能有抑制作用，這說明LPS可以直接或者通過炎性細胞因子以自分泌