雷公藤甲素對(duì)IL-18誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞表達(dá)IL-8 mRNA的影響.pdf

1、目的：雷公藤甲素(Triptolide，TP)是衛(wèi)矛科植物--雷公藤的提取物，具有抗炎、抑制免疫和抗增殖的作用，在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)、腎病綜合癥和支氣管哮喘等。雷公藤甲素對(duì)RA有著顯著的臨床治療效果，但其具體的作用機(jī)理目前尚仍缺乏足夠的認(rèn)識(shí)。RA 是以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病。病理解剖學(xué)資料顯示：急性期RA患者的關(guān)節(jié)內(nèi)浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞80％左右都是功能增強(qiáng)

2、的活性化的中性粒細(xì)胞(polymorphonuelear neutrophils，PMN)，這些活化的中性粒細(xì)胞合成和釋放細(xì)胞毒性顆粒--炎性介質(zhì)是造成關(guān)節(jié)滑膜炎性損傷的直接原因。中性粒細(xì)胞是機(jī)體最重要的炎癥細(xì)胞，在它向關(guān)節(jié)內(nèi)浸潤(rùn)的過程中，受到趨化因子的影響和調(diào)控，其中CXC類趨化因子對(duì)其趨化影響的作用最強(qiáng)、持續(xù)的時(shí)間也最長(zhǎng)。白細(xì)胞介素8(Interleukin-8，IL-8)是代表性的CXC類趨化因子，它對(duì)中性粒細(xì)胞的作用尤為顯著，因

3、此IL-8在炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用。關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞(Synovial fibroblasts，SFs)在關(guān)節(jié)的炎癥中也扮演著十分重要的角色。一方面關(guān)節(jié)中的滑膜成纖維細(xì)胞受多種因素刺激，發(fā)生增生，并浸入關(guān)節(jié)軟骨和周圍的組織，從而導(dǎo)致滑膜增厚甚至關(guān)節(jié)畸形；另一方面SF在局部分泌大量的IL-8等促炎癥因子，趨化更多的中性粒細(xì)胞進(jìn)入關(guān)節(jié)局部，并使之活化，從而加重炎癥的發(fā)展。因此，減少IL-8等趨化因子的產(chǎn)生，阻止中性粒細(xì)胞向關(guān)

4、節(jié)局部的聚集是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。雷公藤甲素在RA病人中發(fā)揮的減輕關(guān)節(jié)腫脹疼痛、減輕局部炎癥的療效，有理由做出這樣的推測(cè)： (1)雷公藤甲素可能是通過抑制SF分泌產(chǎn)生IL-8等趨化因子，降低了趨化到關(guān)節(jié)局部的中性粒細(xì)胞數(shù)量，從而減輕關(guān)節(jié)局部的炎癥： (2)雷公藤甲素可能還降低了中性粒細(xì)胞對(duì)的趨化因子IL-8的敏感性和反應(yīng)性，從而減少中性粒細(xì)胞的趨化，減輕炎癥。 因此，本研究主要目的就是從蛋白水平上和

5、核酸水平上檢測(cè)雷公藤甲素對(duì)體外培養(yǎng)的成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast like synoviocyte，F(xiàn)LS/B型滑膜細(xì)胞)在前炎癥因子IL-18(Interleukin-18，IL-18)刺激下產(chǎn)生IL-8韻影響，深入探討雷公藤甲素抗炎、抗類風(fēng)濕的作用機(jī)理。 方法：運(yùn)用臨床截肢手術(shù)及關(guān)節(jié)鏡檢查所取的骨關(guān)節(jié)滑膜組織進(jìn)行培養(yǎng)，所獲取的滑膜細(xì)胞經(jīng)3～5次傳代純化后，用HE染色法進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察鑒定，用免疫組化法對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志C

6、D68、Vnnentin抗原進(jìn)行鑒定。確定滑膜成纖維細(xì)胞的純度達(dá)98％以上后，創(chuàng)建4個(gè)模型組：A組：無刺激對(duì)照組；B組：IL-18(終濃度為100 ng/ml)誘導(dǎo)組；C組：?jiǎn)我坏睦坠偌姿?終濃度為100ng/ml)處理組；D組：雷公藤甲素預(yù)處理后IL-18處理組。24小時(shí)后用ELISA法對(duì)各組培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中IL-8的水平進(jìn)行檢測(cè)并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；同時(shí)，提取個(gè)模型組細(xì)胞的總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)(reverse transc

7、ription-polymerase chain，reaction，RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞表達(dá)的IL-8mRNA進(jìn)行擴(kuò)增，目的片斷經(jīng)由2％的瓊脂凝膠電泳，電泳條帶在紫外凝膠成像系統(tǒng)(White/Ultraviolet Trasilliominator)上觀察、攝片，用凝膠定量軟件Quantity-one(Bio-Rad)分析系統(tǒng)檢測(cè)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶的光密度值。將IL-8/β2微球蛋白灰度比值作為IL-8mRNA表達(dá)水

8、平的半定量值。 結(jié)果： 1．成纖維樣滑膜細(xì)胞的鑒定：滑膜成纖維細(xì)胞經(jīng)過3～5次傳代后，基本純化，HE染色后鏡下觀察滑膜細(xì)胞的形態(tài)；免疫組化鑒定Vimentin陽性99％以上，CD68陰性99％以上，符合滑膜成纖維細(xì)胞的特點(diǎn)。 2．IL-8在各模型組培養(yǎng)細(xì)胞上清液中的表達(dá)狀況： (1)IL-18誘導(dǎo)組(B組)與無刺激對(duì)照組(A組)比較，IL-8的表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)； (2)單一的雷公藤

9、甲素處理組(C組)與無刺激對(duì)照組比較，IL-8的表達(dá)無顯著性差異； (3)雷公藤甲素預(yù)處理保護(hù)組(D組)與無刺激對(duì)照組(A組)比較，IL-8的表達(dá)無顯著性差異，但與IL-18誘導(dǎo)組(B組)比較，其IL-8的表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。 3．IL-8 mRNA在各模型組細(xì)胞中的表達(dá)情況是：IL-8 mRNA在IL-18刺激組中表達(dá)條帶明顯，在其余各組條帶不明顯，IL-8/β2m光密度比值顯示：IL-18誘導(dǎo)組的滑膜細(xì)胞

10、明顯表達(dá)IL-8 mRNA，與無刺激對(duì)照組比較有顯著性差異；而雷公藤甲素預(yù)處理后IL-18誘導(dǎo)組中IL-8的表達(dá)減弱，與IL-18誘導(dǎo)組比較有顯著性差異。 結(jié)論： (1)經(jīng)免疫組化鑒定，3次傳代培養(yǎng)后的滑膜成纖維細(xì)胞純度大于98％，符合本次實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞的要求，但超過7次傳代的細(xì)胞已開始老化。 (2)IL-18可以誘導(dǎo)人關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞合成和分泌IL-8，與已有的報(bào)道一致。 (3)雷公藤甲素能從蛋白水平和核