雷公藤甲素對(duì)滑膜細(xì)胞Ras-MAPKs和G蛋白-cAMP信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 探討雷公藤甲素對(duì)RA-HFLS Ras-MAPKs及G蛋白-cAMP信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響,并揭示上述兩條信號(hào)傳導(dǎo)通路之間的相互聯(lián)系,為雷公藤治療RA的分子機(jī)制和臨床合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 將不同濃度的TP(0.28、2.8、28、140 nM)與TNF-α誘導(dǎo)及未誘導(dǎo)的RA-HFLS共孵育,采用MTS比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,以觀察TP對(duì)RA-HFLS增殖的影響；通過(guò)Western

2、blot方法檢測(cè)RA-HFLS Ras-MAPKs信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白(Ras、P-P38、p-ERK和p-JNK)的活化水平及G蛋白-cAMP信號(hào)通路中Gi、Gs表達(dá)水平,并采用RT-PCR方法檢測(cè)Gi、Gs mRNA轉(zhuǎn)錄水平,應(yīng)用放射免疫分析法檢測(cè)cAMP含量,以研究TP對(duì)RA—HFLS Ras-MAPKs及G蛋白-cAMP信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響:選用G蛋白-cAMP信號(hào)傳導(dǎo)通路激活劑(Gs激活劑CT、Gi抑制劑PT)和Ras-MAPK

3、s信號(hào)通路的抑制劑(P38通路選擇性抑制劑SB203580、ERK通路選擇性抑制劑PD98059及JNK通路選擇性抑制劑SP600125)預(yù)處理RA-HFLS1h后加入TNF-α誘導(dǎo)不同時(shí)間,通過(guò)Western blot方法檢測(cè)上述兩條通路主要蛋白表達(dá)水平,以探討兩信號(hào)通路間的相互聯(lián)系(cross talk)。
　　 結(jié)果：
　　 1.TP對(duì)RA-HFLS增殖的影響
　　 與空白組相比,經(jīng)TNF-α(10 ng/

4、mL)誘導(dǎo)后細(xì)胞相同傳代時(shí)間下,其形態(tài)及狀態(tài)與空白組相似,但密度明顯增加；與TNF-α誘導(dǎo)組相比,不同濃度TP作用24 h后細(xì)胞數(shù)量明顯減少,并出現(xiàn)不同程度的變形,36 h～48 h后,TP28、140 nM組細(xì)胞變圓變小,并可見(jiàn)細(xì)胞碎片；
　　 TNF-α誘導(dǎo)可明顯提高細(xì)胞的增殖活性(P<0.01),0.28 nM TP對(duì)RA-HFLS增殖無(wú)明顯影響(P>0.05),TP(2.8 nM～140 nM)可顯著抑制RA-HFLS的

5、增殖(P<0.05或P<0.01),其抑制率分別為5.05％、30.83％和43.77％,且呈現(xiàn)顯著的劑量依賴性(P<0.01)。
　　 2.TNF-α誘導(dǎo)不同時(shí)間對(duì)RA-HFLS Ras-MAPKs信號(hào)傳導(dǎo)通路活化水平的影響
　　 3.TP對(duì)RA-HFLS Ras-MAPKs信號(hào)傳導(dǎo)通路活化水平的影響
　　 與空白組相比,TNF-α可顯著提高RA-HFLS Ras、p-P38、P—ERK及p-JNK的表達(dá)(P<

6、0.01)；
　　 與單純TNF-α誘導(dǎo)組相比,2.8 nM TP可顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的RA-HFLSRas、p-P38、p-ERK及p-JNK的表達(dá)(P<0.05),隨著TP濃度的升高,這種抑制作用也隨之增強(qiáng)(P<0.05或P<0.01),且TP不同濃度組之間比較,差異具有顯著性(P<0.05),當(dāng)TP濃度達(dá)140 nM時(shí),對(duì)上述蛋白表達(dá)的抑制率可分別達(dá)62.6％、57.5％、66.9％、59.0％:
　　 與空白

7、組比較,2.8 nM TP對(duì)未經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)的RA-HFLS Ras、P-P38、p-ERK及p-JNK的表達(dá)無(wú)顯著影響(P>0.05),而當(dāng)其濃度由28 nM升至140 nM,TP表現(xiàn)出顯著抑制作用(P<0.05或P<0.01),其中140 nMTP對(duì)上述各蛋白的抑制率可達(dá)32.0％、32.9％、33.9％、19.7％,但TP不同濃度組之間比較,差異不具有顯著性(P>0.05)；
　　 TNF-α誘導(dǎo)給藥組與TNF-α未誘導(dǎo)

8、給藥組比較,2.8 nM TP對(duì)RA-HFLS Ras、p-P38及p-ERK表達(dá)的抑制率兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),只對(duì)p-JNK的抑制率兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；28 nM TP對(duì)RA-HFLS Ras及p-P38表達(dá)的抑制率兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,對(duì)p-ERK及p-JNK的抑制率兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)；而140 nM TP對(duì)上述蛋白表達(dá)的抑制率兩組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)。

9、>　　 4.TP對(duì)RA-HFLS Gi2、Gi3和Gs蛋白表達(dá)水平的影響
　　 與空白組相比,TNF-α誘導(dǎo)6 h可顯著上調(diào)Gi2、Gi3蛋白表達(dá),同時(shí)下調(diào)Gs表達(dá)(P<0.01)；
　　 與單純TNF-α誘導(dǎo)組相比,2.8 nM TP可顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的RA-HFLSGi2的表達(dá)(P<0.05),但對(duì)Gi3的抑制作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),并顯著上調(diào)Gs表達(dá)(P<0.01),且隨著TP濃度的升高,這種抑制

10、作用或增強(qiáng)作用也隨之增強(qiáng),當(dāng)TP濃度達(dá)140 nM時(shí),對(duì)Gi2、Gi3蛋白的抑制率可分別達(dá)49.2％、54.1％,而對(duì)Gs表達(dá)上調(diào)率可達(dá)90.3％,同時(shí)TP不同濃度組之間比較,除中劑量與高劑量組對(duì)Gi2的抑制作用及對(duì)Gs的增強(qiáng)作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外,其他各組間比較,TP對(duì)Gi2、Gi3的抑制作用與對(duì)Gs的增強(qiáng)作用均具有組間顯著性差異(P<0.05或P<0.01)；
　　 與空白組相比,2.8 nM TP即可顯著抑制未經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)

11、的RA-HFLS Gi2與Gi3的表達(dá)(P<0.05或P<0.01),而對(duì)Gs表達(dá)的增強(qiáng)作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,當(dāng)TP濃度由28 nM升至140 nM,其表現(xiàn)出的抑制或增強(qiáng)作用也隨之增強(qiáng)(P<0.05或P<0.01),其中140 nM TP對(duì)Gi2與Gi3的抑制率可達(dá)44.6％、30.4％,對(duì)Gs表達(dá)上調(diào)率可達(dá)17.2％,TP不同濃度組間比較顯示,相鄰的劑量組間沒(méi)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而低劑量與高劑量之間則表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05);
　　

12、 TNF-α誘導(dǎo)給藥組與TNF-α未誘導(dǎo)給藥組比較,2.8 nM TP對(duì)RA-HFLS Gi2、Gi3表達(dá)的抑制率兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),對(duì)Gs表達(dá)的上調(diào)率兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；28 nM TP對(duì)RA-HFLS Gi2、Gi3表達(dá)的抑制率兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),對(duì)Gs表達(dá)的上調(diào)率兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；而140 nM TP對(duì)Gi2表達(dá)的抑制率兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),對(duì)Gi3表達(dá)的抑制

13、率與對(duì)Gs表達(dá)的上調(diào)率兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　 5.TP對(duì)RA—HFLS Gi和Gs轉(zhuǎn)錄水平的影響
　　 與空白組相比,TNF-α誘導(dǎo)6 h可顯著上調(diào)Gi mRNA表達(dá),同時(shí)下調(diào)Gs mRNA表達(dá)(P<0.01):
　　 與單純TNF-α誘導(dǎo)組相比,2.8 nM TP即可顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的RA-HFLSGi mRNA轉(zhuǎn)錄水平,并顯著上調(diào)Gs mRNA表達(dá)(P<0.01),且隨著TP濃度的升高

14、,這種抑制作用或上調(diào)作用也隨之增強(qiáng)(P<0.01),當(dāng)TP濃度達(dá)140 nM時(shí),對(duì)Gi mRNA轉(zhuǎn)錄水平的抑制率可達(dá)98.1％,而對(duì)Gs mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)率可達(dá)233.3％。同時(shí)TP不同濃度組之間比較,除低劑量與中劑量組對(duì)Gi基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用無(wú)顯著性差異,同時(shí)中劑量與高劑量組對(duì)Gs表達(dá)的增強(qiáng)作用無(wú)顯著性差異外,其他各組間比較,均具有組間顯著性差異(P<0.05或P<0.01)；
　　 與空白組相比,140 nM TP對(duì)TN

15、F-α未誘導(dǎo)的RA-HFLS Gi tuRNA轉(zhuǎn)錄水平的抑制率可達(dá)96.7％,而對(duì)Gs mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)率可達(dá)40.0％(P<0.05);
　　 6.TP對(duì)RA-HFLS cAMP含量的影響
　　 與空白組相比,TNF-α誘導(dǎo)6h可顯著下調(diào)RA-HFLS胞漿cAMP含量,其下調(diào)率為12.5％；而TP可顯著上調(diào)TNF-α誘導(dǎo)引起的RA-HFLS cAMP含量的降低,低、中、高劑量上調(diào)率分別為10.4％、18.8％、33

16、.3％,呈現(xiàn)出劑量依賴性,同時(shí)與空白組相比,140 nM TP也可顯著升高未誘導(dǎo)的RA—HFLS cAMP水平(P<0.05或P<0.01)。
　　 7.Ras-MAPKs與G蛋白-cAMP信號(hào)傳導(dǎo)通路在RA-HFLS中的交互調(diào)節(jié)
　　 Gi蛋白抑制劑PT(1μg/mL)和Gs蛋白激活劑CT(10μg/mL)可有效抑制TNF-α(10 ng/mL)誘導(dǎo)的RA-HFLS Ras、p—P38、p-ERK和p-JNK蛋白表達(dá)水

17、平的上調(diào)；P38通路抑制劑SB203580(10μM)、ERK通路抑制劑PD98059(50μM)及JNK通路抑制劑SB600125(25μM)可有效抑制TNF-α誘導(dǎo)的RA—HFLS Gi2、Gi3蛋白表達(dá)水平的升高,并逆轉(zhuǎn)Gs表達(dá)水平的降低。
　　 結(jié)論：:
　　 1.TNF-α可明顯誘導(dǎo)RA-HFLS的增殖,并引起Ras-MAPKs信號(hào)傳導(dǎo)通路的異?；罨癎蛋白-cAMP信號(hào)通路的異常抑制。
　　 2.TP

18、可顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的RA—HFLS的增殖。
　　 3.TP可降低ERK、JNK和P38的磷酸化和Ras表達(dá)水平,從而抑制RA-HFLSRas-MAPKs信號(hào)傳導(dǎo)通路的異?；罨?。
　　 4.TP可調(diào)節(jié)Gi和Gs的失衡,提高cAMP水平,從而調(diào)節(jié)G蛋白-cAMP信號(hào)通路的失衡。
　　 5.Ras-MAPKs信號(hào)傳導(dǎo)通路與G蛋白-cAMP信號(hào)通路間存在著交互調(diào)節(jié)關(guān)系。
　　 6.TP一方面直接抑制Ras-