減蛋綜合征病毒Hexon蛋白誘導(dǎo)鴨胚成纖維細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、減蛋綜合征病毒(Egg drop syndrome virus，EDSV)來源于鴨，被命名為鴨腺病毒Ⅰ型，EDSV主要引起雞的產(chǎn)蛋率及蛋品質(zhì)的下降。近年來，研究表明EDSV可以導(dǎo)致雛鴨發(fā)生急性呼吸道感染，甚至出現(xiàn)死亡。目前，對(duì)人類感染腺病毒進(jìn)行了廣泛的研究，但是對(duì)于禽類感染EDSV的機(jī)制研究較少。在本研究中，EDSV及其Hexon蛋白均可以誘導(dǎo)鴨胚胎成纖維細(xì)胞(Duck embryonic fibroblast，DEF)發(fā)生細(xì)胞凋亡，從

2、而為研究該病毒對(duì)禽類的致病機(jī)理提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)及科學(xué)依據(jù)。本試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.將EDSV接種DEF單層細(xì)胞后檢測(cè)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)及病毒增殖水平。結(jié)果表明，EDSV感染DEF細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞界限不清楚，貼附性降低，細(xì)胞漂浮增多。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)EDSV在DEF細(xì)胞中的增殖規(guī)律表明:病毒水平在感染后24 h～60 h持續(xù)增殖。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的病毒血凝效價(jià)檢測(cè)表明，隨著感染時(shí)

3、間的增加，病毒血凝效價(jià)從感染初期23上升至28。以上說明EDSV可以在DEF細(xì)胞上穩(wěn)定持續(xù)的增殖并引起病變效應(yīng)。
　　2.利用流式細(xì)胞術(shù)研究EDSV誘導(dǎo)DEF細(xì)胞發(fā)生凋亡的結(jié)果表明，EDSV感染DEF細(xì)胞后24 h時(shí)凋亡率開始升高，在感染后60 h時(shí)凋亡率達(dá)到29.1％，差異顯著(P＜0.05)。TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)凋亡陽性細(xì)胞數(shù)目在感染36 h～60 h時(shí)顯著增加。利用Caspase活性實(shí)驗(yàn)以及Western blot法檢測(cè)表明，

4、EDSV感染能夠激活Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9，并且上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Bax的表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的表達(dá)，Bax/Bcl-2的比率隨感染時(shí)間延長(zhǎng)逐漸上升且差異顯著(P＜0.05)。
　　3.成功構(gòu)建EDSV Hexon蛋白的真核載體pCDNA-3.1-Hexon，轉(zhuǎn)染pCDNA-3.1-Hexon的DEF細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24 h、36h時(shí)Hexon的表達(dá)量較高，隨后有所下降。利用TUNEL染色法發(fā)現(xiàn)，DE

5、F轉(zhuǎn)染pCDNA-3.1-Hexon后發(fā)生凋亡的陽性細(xì)胞的數(shù)目較對(duì)照組陽性細(xì)胞顯著升高(P＜0.05)，并且同組轉(zhuǎn)染細(xì)胞在24 h、36 h時(shí)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目較48 h、60 h時(shí)顯著升高(P＜0.05)。Caspase活性和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示DEF細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCDNA-3.1-Hexon后， Caspase-8、Caspase-9及Caspase-3的活性在24 h、36 h時(shí)被激活。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)Bax的表達(dá)升高，