3株鴨源呼腸孤病毒對鴨胚成纖維細胞致病性研究.pdf

1、本研究分別將本實驗室先后分離鑒定并保存的3株(HP09318株、HP080421株、HP081122株)鴨源禽呼腸孤病毒(Duck Reovirus，DRV)人工感染鴨胚和鴨胚成纖維細胞(Duck embryo fibroblast，DEF)，運用細胞培養(yǎng)技術、光鏡、電鏡、RT-PCR、ELISA等多種研究方法，分別對感染鴨胚成纖維細胞后，病毒的增殖情況、細胞的病理變化、TNF-α表達水平進行系統(tǒng)的研究。
　　 人工感染鴨胚結(jié)果

2、顯示：3株DRV經(jīng)絨毛尿囊膜途徑接種于9～11d鴨胚，胚體在3～6d內(nèi)全部死亡，胚體發(fā)育不良，個體偏小，全身皮膚出血，肝臟表面可見黃白色壞死點。
　　 3株DRV接種于DEF的病理變化：24h開始出現(xiàn)細胞病變，表現(xiàn)為細胞變圓，細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，部分細胞發(fā)生溶解，48h病變加重，大量死亡細胞懸浮于培養(yǎng)基中，其中可以見到懸浮的巨細胞。細胞經(jīng)H.E染色后，鏡下可見細胞呈拉網(wǎng)狀，部分細胞壞死，核碎裂，并且可見含有多個細胞核的巨細胞。在細胞

3、質(zhì)中觀察到嗜酸性的包涵體顆粒。將細胞制作超薄切片，在透射電鏡下觀察，感染細胞出現(xiàn)大小不一的囊泡，可見板層樣結(jié)構，細胞質(zhì)中可觀察到病毒顆粒。
　　 3株DRV在DEF中的增殖規(guī)律：在接種病毒后12h、24h、48h、72h和96h分別收集細胞、細胞培養(yǎng)夜以及兩者的混合物，應用熒光定量RT-PCR方法檢測病毒含量，結(jié)果顯示，接毒后12h三者中病毒含量均較低；24h三者病毒含量都呈上升趨勢，而且細胞與混合物中病毒含量最高；48h細胞與

4、混合物中病毒含量相比24h下降，而細胞培養(yǎng)液中病毒含量達到最高；48h～96h三者病毒含量呈降低趨勢。
　　 3株DRV病毒感染DEF后TNF-α含量變化：應用ELISA方法檢測其蛋白水平，結(jié)果顯示接種后12h對照組中TNF-α的含量高于接毒組，24h以后對照組與接毒組中TNF-α含量均呈增加趨勢，且接毒組高于對照組，96h檢測接毒組中TNF-α含量下降低于對照組；熒光定量RT-PCR方法檢測其mRNA表達水平，結(jié)果顯示DEF在

5、接種DRV后24h～48h TNF-αmRNA表達水平明顯上調(diào)，96h后TNF-α基因表達水平下調(diào)。
　　 結(jié)果表明：本實驗室分離保存的3株鴨源呼腸孤病毒可以在DEF中成功復制增殖，并致使細胞產(chǎn)生明顯的病理變化，被感染細胞透射電鏡下可觀察到形態(tài)一致病毒顆粒。3株DRV感染細胞導致接毒組與對照組細胞中TNF-α表達水平存在明顯差異，3株DRV感染DEF后，病毒的增殖、病毒所致細胞的病理變化與細胞中TNF-α表達水平三者之間呈正相關