NCOR啟動子甲基化對巨噬細胞炎癥的調(diào)控作用.pdf

1、急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫癥(ARDS)嚴(yán)重威脅著人民的生命安全。嚴(yán)重的感染（如膿毒癥）是引起ALI/ARDS主要原因之一。盡管目前對ALI/ARDS的研究取得了一定進展，但仍無有效的藥物及治療措施，其死亡率仍居高不下。因此深入探究ALI/ARDS炎癥反應(yīng)機制尋找新的ALI/ARDS的防治靶點顯得尤為重要和迫切。國內(nèi)外研究表明在急性肺損傷發(fā)生、發(fā)展過程中肺泡巨噬細胞發(fā)揮著重要作用。因此，深入研究巨噬細胞在這一過程中的作用有望為A

2、LI/ARDS的防治提供新策略、手段。
　　核受體協(xié)同抑制因子(nuclear receptor corepressor,NCOR)是一種核轉(zhuǎn)錄抑制因子。研究顯示NCoR可通過TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或抑制NF-κB和AP-1調(diào)節(jié)炎癥。但NCOR如何被調(diào)控，其機制尚不清楚。
　　DNA甲基化是高等真核生物基因組中的主要表觀遺傳修飾，其在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)催化下參與基因調(diào)控從而引起疾病的發(fā)生發(fā)展。本課題擬采用脂多糖(LPS

3、)誘發(fā)的巨噬細胞炎癥模型，探討NCOR在炎癥反應(yīng)中的作用及其調(diào)控機制。
　　目的：
　　1.闡明NCOR在LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的作用;
　　2.探討NCOR啟動子甲基化的機制以及在炎癥反應(yīng)中的作用。
　　方法：
　　1.LPS刺激巨噬細胞對NCOR的表達及炎癥的影響
　　用1ug/ml的LPS分別處理小鼠巨噬細胞RAW264.724h和48h，Western blot檢測NCOR蛋白的表達水平，Rea

4、l time-PCR檢測NCOR、TNF-α、IL-6mRNA水平。熒光素酶報告基因檢測NF-κB啟動子活性。
　　2.LPS刺激巨噬細胞對NCOR基因啟動子甲基化的影響
　　LPS刺激細胞48h后，應(yīng)用MSP檢測NCOR啟動子甲基化情況，Western blot檢測DNMT3b的表達變化。Real time-PCR檢測5'-aza和LPS聯(lián)合處理細胞后NCORmRNA的表達水平。
　　3.下調(diào)DNMT3b對NCOR及

5、炎癥的影響
　　巨噬細胞轉(zhuǎn)染DNMT3b siRNA后，再用LPS處理巨噬細胞，分別應(yīng)用Western blot和Real time-PCR檢測DNMT3b的表達水平，以及DNMT3b siRNA和LPS聯(lián)合作用下NCOR、TNF-α、IL-6的表達水平和NF-κB的啟動子活性。
　　結(jié)果：
　　1.LPS刺激細胞24、48h后，NCOR蛋白和mRNA表達顯著下調(diào)(p＜0.05）;同時炎癥因子TNF-α、IL-6mRN

6、A表達水平、NF-κB的啟動子活性顯著上升(p＜0.05）。
　　2.LPS可誘導(dǎo)NCOR啟動子發(fā)生甲基化，DNMT3b蛋白的表達水平升高，用5'-aza和LPS聯(lián)合處理細胞后NCOR mRNA水平較LPS組有顯著上升(p＜0.05）。
　　3.DNMT3b siRNA可顯著下調(diào)DNMT3b蛋白和mRNA水平，升高NCOR表達水平，從而抑制TNF-α、IL-6的表達水平和NF-κB的啟動子活性(p＜0.05）。
　　結(jié)