bpi基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化及其對仔豬e.colif18抗性的調(diào)控作用分析

1、國家自然科學(xué)基金( N o ．3 11 7 2 1 8 3 ，N o ．3 11 4 0 0 2 7 )N a t i o n a l N a t u r a lS c i e n c e F u n d s( N o ．3 11 7 2 1 8 3 ，N o ．3 11 4 0 0 2 7 )轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)( N o ．2 0 1 4 Z X 0 8 0 0 6 0 1 B )N a t i o n a lM a j

2、 o rT e c h n o l o g y P r o j e c t so f G e n e t i c a l l y M o d i f i e d O r g a n i s m sB r e e d i n g( N o ．2 0 14 Z X 0 8 0 0 6 0 1B )江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目( P A P D )P r i o r i t yA c a d e m i cP r o g r a m D

3、e v e l o p m e n t o f J i a n g s u H i g h e r E d u c a t i o nI n s t i t u t i o n s ( P A P D )2 揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文在斷奶后的3 5 曰齡，B P ／基因在十二指腸中的表達(dá)水平極顯著高于7 日齡( P < 0 ．0 1 ) ；2 8 及3 5 日齡引V 在空腸組織中的m R N A 表達(dá)水平極顯著高于7 、1 4 和2

4、1 日齡個(gè)體中的表達(dá)水平( P < 0 ．0 1 ) ；進(jìn)一步比較分析梅山斷奶仔豬Ec o l iF 1 8 抗性型／易感型個(gè)體腸道組織中B Ⅳ基因的差異表達(dá)，結(jié)果表明，B Ⅳ基因在抗性型仔豬十二指腸中的表達(dá)量極顯著高于易感型個(gè)體( P < 0 ．0 1 ) 。本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，B 尸，基因在梅山豬仔豬腸道組織中的表達(dá)同樣呈現(xiàn)明顯的組織特異性和發(fā)育性表達(dá)規(guī)律，而且B 肼基因的表達(dá)上調(diào)也有利于提高梅山豬斷奶仔豬對F 1 8

5、 大腸桿菌的抗性。2 ．運(yùn)用B S P ( B i s u l f i t e S e q u e n c i n gP C R ) 測序法檢測梅山豬及蘇太豬斷奶仔豬十二指腸組織中B Ⅳ基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，分析重要甲基化位點(diǎn)對B P l 基因m R N A 表達(dá)水平影響和調(diào)控作用。生物信息學(xué)分析表明，豬引?；蛲怙@子1 及上游5 0 0 0 b p 區(qū)域存在一個(gè)C p G 島，共包含1 0 個(gè)C p G 位點(diǎn)。B S P 測序結(jié)果表

6、明，蘇太豬B 肼基因啟動(dòng)子區(qū)1 0個(gè)C p G 位點(diǎn)甲基化程度普遍高于梅山豬個(gè)體，甲基化水平與表達(dá)量相關(guān)性分析表明，B Ⅳ基因C p G 島整體的甲基化程度與m R N A 表達(dá)之間呈一定負(fù)相關(guān)性( r = ．0 ．6 8 6r o ．0 5 = O ．8 1 1 ) ，其中C p G ．3 、C p G ．7 、C p G ．9 位點(diǎn)呈顯著負(fù)相關(guān)( P < 0 ．0 5 ) ，C p G ．2 呈極顯著負(fù)相關(guān)( 尸< 0

7、．0 1 ) 。說明該區(qū)域C p G ．2 、C p G ．3 、C p G ．7 、C p G ．9 等重要的甲基化位點(diǎn)可能抑制了基因的表達(dá)，今后有望通過對這些位點(diǎn)的去甲基化提高B Ⅳ的表達(dá)水平，從而提高腸道組織對于革蘭氏陰性菌的抵抗能力。3 ．采用B S P ( B i s u l f i t eS e q u e n c i n gP C R ) + M i s e q 測序的方法，以課題組前期建立的蘇太斷奶仔豬E c o l i

8、F 1 8 抗性型／易感型個(gè)體的腸道組織為檢測對象，分析重要甲基化位點(diǎn)對B P ／基因r n R N A 表達(dá)水平的影響和調(diào)控作用，探討B(tài) Ⅳ基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平在仔豬抵抗E ．c o l iF 1 8 感染過程中的調(diào)控機(jī)制，B S P + M i s e q 檢測結(jié)果表明，m C ．3 、m C ．1 4 和m C ．1 5 等位點(diǎn)的甲基化水平在抗性型／易感型個(gè)體的腸道組織中存在很大的差異；E c o l iF 1 8 抗性型／易感

9、型個(gè)體在腸道組織中B Ⅳ基因整體甲基化水平與表達(dá)量呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)( r = ．0 ．6 1 1 ，r o ．o s = 0 ．4 9 7 ) ，m C ．7 位點(diǎn)呈極顯著負(fù)相關(guān)( r 一0 ．6 4 1 ，r o0 1 = 0 ．6 2 3 ) ，m C ．1 5 位點(diǎn)存在顯著負(fù)相關(guān)( r 一0 ．5 6 4 ) 。在一定程度上說明，Ec o l i F l 8 抗性型／易感型個(gè)體的表達(dá)差異與B Ⅳ基因部分位點(diǎn)的甲基化有關(guān)，m C ．1

10、 5 位點(diǎn)的甲基化可能在E ．c o l i F 1 8 抗性的過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。4 ．采用B S P ( B i s u l f i t eS e q u e n c i n gP C R ) + M i s e q 測序的方法，檢測蘇太斷奶仔豬1 1個(gè)不同組織B 肼基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，探討B(tài) 刀基因的組織特異性表達(dá)是否與甲基化修飾有關(guān)。對甲基化擴(kuò)增片段分析發(fā)現(xiàn)，該片段共包含了1 5 個(gè)C G 位點(diǎn)，且都發(fā)生了不同程度的