siRNA靶向誘導(dǎo)肝素酶啟動子甲基化對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移調(diào)控作用的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)通過檢測胃癌中肝素酶基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)其與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且與腫瘤分化程度具有一致性，而且肝素酶在腫瘤中的表達(dá)情況也隨甲基化狀態(tài)發(fā)生改變，這與肝素酶在不同分化程度的胃癌組織中的表達(dá)情況相一致，說明肝素酶基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)與肝素酶表達(dá)密切相關(guān)，而肝素酶的表達(dá)情況與胃癌組織的侵襲性和轉(zhuǎn)移惡能也密切相關(guān)，通過siRNA 靶向干擾腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)性基因肝素酶的啟動子區(qū)域促使其甲基化可以明顯降低肝素酶的表達(dá)，從而可

2、以有效的從表觀遺傳學(xué)角度降低腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。這為腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和有效治療及預(yù)防轉(zhuǎn)移提供了新的理論依據(jù)和實(shí)踐方案。
　　 第一部分：肝素酶在胃癌中表達(dá)情況及臨床意義的研究
　　 目的：探討肝素酶(heparanase)在胃癌組織和不同分化程度的胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)情況的差異與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。
　　 方法：收集72例胃癌手術(shù)后組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法(s

3、treptavidinbiotin peroxidase complex，SABC)，免疫熒光方法(immunofluorescence，IF)，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫蛋白印記法(Western Blot)檢測胃癌組織和細(xì)胞系中肝素酶mRNA和蛋白的表達(dá)，并結(jié)合臨床病理資料進(jìn)行回顧分析。
　　 結(jié)果：72例胃癌組織中肝素酶的表達(dá)率為免疫組化77.8% (56/72)、RT-PCR 93.1%(67/72)和W

4、estern Blot 83.3% (60/72)。肝素酶蛋白表達(dá)與胃癌的腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期相關(guān)(P<0.05)。而與患者年齡、性別、腫瘤部位及大小關(guān)系之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。RT-PCR與Western blot結(jié)果顯示，肝素酶mRNA和蛋白在3 株胃癌細(xì)胞株中均有表達(dá)，但表達(dá)水平有差異，其中以TMK-1中表達(dá)最強(qiáng)，SGC-7901 次之，MKN-28表達(dá)最弱。
　　 結(jié)論：胃癌中肝素酶mR

5、NA和蛋白表達(dá)增多，其與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、分化程度等臨床病理資料密切相關(guān)；肝素酶表達(dá)對對胃癌的預(yù)測和預(yù)后的判斷有一定的參考價值，為其診療提供了相當(dāng)明確的理論依據(jù)。
　　 第二部分：肝素酶啟動子區(qū)域在胃癌中甲基化情況的解析
　　 目的：以腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)性基因肝素酶為靶標(biāo)，探討并明確胃癌組織和胃癌細(xì)胞株中肝素酶啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)。
　　 方法：提取不同不同分化程度和病理類型胃癌組織及細(xì)胞株基因組D

6、NA，經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾，專業(yè)軟件設(shè)計甲基化引物，運(yùn)用甲基化PCR(MSP)、甲基化克隆測序(BSP)等分子生物學(xué)方法檢測肝素酶基因啟動子區(qū)域CpG 島甲基化狀態(tài)，并初步確定甲基化預(yù)干擾位點(diǎn)。
　　 結(jié)果：甲基化PCR檢測肝素酶啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)在胃癌組織和細(xì)胞系中肝素酶啟動子區(qū)域呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)，且隨腫瘤細(xì)胞分化程度的降低呈現(xiàn)不同程度的去甲基化，其中以TMK-1中表現(xiàn)非甲基化頻率最強(qiáng)，SGC-7901 次之，MKN-28 最弱。

7、r>　　 亞硫酸氫鹽修飾DNA 序列(BSP)分析檢測啟動子區(qū)域14個CG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，不是所有的有非甲基化的組織中所出現(xiàn)甲基化的頻率一致，且出現(xiàn)非甲基化的位點(diǎn)也并不固定。
　　 結(jié)論：肝素酶基因啟動子區(qū)域在腫瘤組織中較正常組織呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)，在包含轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件EGR1 附近的14個CG位點(diǎn)的甲基化頻率隨腫瘤細(xì)胞分化程度的降低而呈現(xiàn)不同程度的降低，但其具體去甲基化位點(diǎn)分布不一致，且并不固定。不同分化程度的腫瘤細(xì)胞株中

8、肝素酶基因啟動子區(qū)域的甲基化檢測結(jié)果與組織標(biāo)本中的甲基化頻率相一致，為進(jìn)一步體外探討肝素酶基因啟動子區(qū)域甲基化對胃癌腫瘤生物學(xué)行為的作用奠定了研究基礎(chǔ)。
　　 第三部分：siRNA 靶向干擾肝素酶啟動子對胃癌中甲基化影響情況的研究
　　 目的：研究siRNA干擾肝素酶啟動子區(qū)域?qū)ξ赴┲屑谆癄顟B(tài)的影響情況，并篩選出誘導(dǎo)肝素酶啟動子甲基化的siRNA 序列，建立腫瘤特異性siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)體系。
　　 方法：構(gòu)建靶向誘

9、導(dǎo)肝素酶基因啟動子區(qū)域甲基化及轉(zhuǎn)錄沉默的短發(fā)卡小干擾RNA(shRNA)表達(dá)質(zhì)粒pGenesiL-1，轉(zhuǎn)染表達(dá)肝素酶的不同分化程度的胃癌細(xì)胞株MKN-28（高分化）、SGC-7901（中分化）、TMK-1（低分化），以實(shí)現(xiàn)對肝素酶表達(dá)的沉默，并對所設(shè)計不同位點(diǎn)序列siRNA 進(jìn)行篩選，為設(shè)計特異性siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)體系和進(jìn)一步探討肝素酶在胃癌侵襲與轉(zhuǎn)移中的作用打下堅實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 結(jié)果：重組質(zhì)粒測序結(jié)果與Genebank中的肝素酶

10、基因cDNA 序列相符，轉(zhuǎn)染MKN-28、SGC-7901、TMK-1細(xì)胞后，熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)；轉(zhuǎn)染后甲基化PCR檢測檢測肝素酶啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)顯示在site1、site2轉(zhuǎn)染序列組細(xì)胞中均出現(xiàn)甲基化趨勢，而在對照組中檢測甲基化未見明顯變化。TMK-1和SGC-7901細(xì)胞在site1、site2轉(zhuǎn)染序列組中均出現(xiàn)甲基化趨勢，而MKN-28細(xì)胞則只在site2轉(zhuǎn)染序列組中有甲基化趨勢。而在其他轉(zhuǎn)染序列組中均未見

11、明顯甲基化狀態(tài)的改變。
　　 結(jié)論：靶向肝素酶基因啟動子區(qū)域誘導(dǎo)其甲基化shRNA表達(dá)載體構(gòu)建無誤，并針對不同甲基化位點(diǎn)篩選有效誘導(dǎo)肝素酶基因啟動子區(qū)域甲基化的siRNA，隨腫瘤細(xì)胞分化程度的降低，siRNA誘導(dǎo)其甲基化的頻率升高，這為靶向特定性基因啟動子區(qū)域CpG 島，而不是其編碼區(qū)的siRNA 能在人類細(xì)胞中誘導(dǎo)該基因DNA甲基化，并導(dǎo)致該基因在轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生基因沉默提供了理論研究依據(jù)，為進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制建立了研究模型,并

12、為將來高效精確靶向表觀遺傳調(diào)控基因表達(dá)奠定了一定的研究基礎(chǔ)。
　　 第四部分：靶向誘導(dǎo)肝素酶啟動子甲基化對肝素酶表達(dá)情況及胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力影響的研究
　　 目的：探討靶向siRNA誘導(dǎo)肝素酶啟動子甲基化對肝素酶表達(dá)的影響及對胃癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用，并探討及其作用機(jī)制。
　　 方法：繪制轉(zhuǎn)染前后各細(xì)胞組生長曲線，MTT法檢測細(xì)胞增殖活力，通過Western Blot、實(shí)時定量PCR檢測肝素酶在siRNA干

13、擾前后轉(zhuǎn)錄水平基因沉默前后的變化情況，Transwell 侵襲小室侵襲實(shí)驗(yàn)和黏附實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的侵襲能力的改變，評價siRNA誘導(dǎo)肝素酶啟動子區(qū)域甲基化對肝素酶表達(dá)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控作用及對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的表觀遺傳調(diào)控作用。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染siRNA干擾各組細(xì)胞后RT-PCR和Western blot檢測肝素酶表達(dá)結(jié)果顯示，site1、site2轉(zhuǎn)染序列組干擾效果最強(qiáng)，但其相應(yīng)的肝素酶表達(dá)并不隨細(xì)胞分化程度的降低而降低，其

14、與肝素酶啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)各組之間的變化情況呈同向的趨勢，兩者之間有明顯的相關(guān)性，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。siRNA干擾后細(xì)胞生長周期檢測細(xì)胞增殖情況結(jié)果顯示各轉(zhuǎn)染序列組中site1、site2轉(zhuǎn)染序列組對細(xì)胞的增殖抑制作用最為明顯，site3、site4組次之，而site5組作用最弱。
　　 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中site1、site2轉(zhuǎn)染序列組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于空白對照組(48±4)(P<0.05)，site3、site4組

15、次之，而site5組作用最弱。細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)中site1、site2轉(zhuǎn)染序列組黏附細(xì)胞數(shù)顯著低于空白對照組(48±4)(P<0.05)，site3、site4組次之，而site5組作用最弱。
　　 結(jié)論：肝素酶基因啟動子區(qū)域siRNA干擾不同分化程度胃癌細(xì)胞系后，肝素酶表達(dá)發(fā)生明顯的變化，但并不隨分化程度降低而降低，與分化程度無明顯相關(guān)性。肝素酶表達(dá)的變化趨勢與其在不同分化程度的胃癌組織中的表達(dá)情況不相一致的結(jié)果顯示通過誘導(dǎo)肝素酶

16、基因啟動子區(qū)域甲基化雖然能夠降低肝素酶的表達(dá)，但是其與肝素酶基因啟動子區(qū)域甲基化頻率的相關(guān)性并不具有統(tǒng)計學(xué)意義。其具體原因可能與所誘導(dǎo)的甲基化位點(diǎn)本身的功能以及誘導(dǎo)的甲基化的頻率變化幅度有關(guān)，這涉及到siRNA誘導(dǎo)基因DNA 甲基化的具體作用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究來證實(shí)。通過siRNA 靶向干擾腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)性基因肝素酶的啟動子區(qū)域促使其甲基化可以明顯降低肝素酶的表達(dá)，從而可以有效的從表觀遺傳學(xué)角度降低腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，這為腫瘤的早期