啟動(dòng)子DNA甲基化在調(diào)控?cái)M南芥離體苗再生中的作用研究.pdf

1、植物離體器官發(fā)生（invitroorganogenesis）是指植物的離體組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成離體苗、根或花芽等器官的過程。其理論基礎(chǔ)是植物細(xì)胞具有全能性，已經(jīng)分化的細(xì)胞能夠重新獲得干細(xì)胞的分化潛能，并經(jīng)過分化形成新的組織和器官到再生植株。植物離體苗再生是離體器官發(fā)生的一種方式，其可進(jìn)一步發(fā)育成完整植株。
　　 DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾形式。目前，DNA甲基化研究多集中在總基因組DNA甲基化水平與植物生長(zhǎng)

2、發(fā)育關(guān)系上，有關(guān)特定基因甲基化而影響基因表達(dá)，進(jìn)而影響植物生長(zhǎng)、發(fā)育及體外離體苗再生的研究還鮮有報(bào)道。
　　 本研究利用擬南芥離體培養(yǎng)體系，擬開展基因啟動(dòng)子DNA甲基化在離體苗再生中的作用研究，為進(jìn)一步揭示擬南芥細(xì)胞全能性的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。主要進(jìn)行了以下研究:1）受DNA甲基化調(diào)控且參與離體苗再生的目標(biāo)基因發(fā)掘（包括:參與離體苗再生的候選基因篩選、候選基因啟動(dòng)子DNA甲基化位點(diǎn)、水平、模式及其與基因表達(dá)水平關(guān)系分析;候選基因組

3、蛋白甲基化及乙?；癄顟B(tài)及其與甲基化關(guān)系分析）;2）候選基因DNA甲基化在調(diào)控離體苗再生中的作用及其分子機(jī)制研究（包括:候選基因突變體離體苗再生能力鑒定、SRF去甲基化對(duì)離體苗再生的影響;SRF調(diào)控的離體苗再生相關(guān)靶基因的發(fā)掘及其相互作用關(guān)系驗(yàn)證），為進(jìn)一步闡明目標(biāo)基因的DNA甲基化在離體苗再生中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 另一方面，利用大豆在鹽及非鹽脅迫下的基因表達(dá)譜，發(fā)掘了發(fā)生DNA甲基化的鹽誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子基因，并分析了它們?cè)诓?/p>

4、同鹽脅迫處理下的表達(dá)水平、DNA甲基化及組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)變化及其相互關(guān)系。
　　 主要的研究過程和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1.啟動(dòng)子DNA甲基化在調(diào)控?cái)M南芥離體苗再生中的作用研究
　　 1.1受DNA甲基化調(diào)控且參與離體苗再生的候選基因發(fā)掘
　　 1.1.1參與離體苗再生的候選基因篩選
　　 胚性愈傷組織(RC)與非胚性愈傷組織(NRC)的獲得:RC為黃綠色，含瘤狀突起和離體苗，具有高頻率的離體苗再

5、生能力;NRC為淺綠色、粉粒狀，無離體苗再生能力。
　　 參與離體苗再生的候選基因的篩選:1）RC與NRC的基因表達(dá)譜分析表明:1432個(gè)基因在RC中上調(diào)表達(dá)，1211個(gè)基因在NRC中上調(diào)表達(dá)。2）利用qRT-PCR驗(yàn)證了芯片結(jié)果的可靠性。3）根據(jù)基因功能注釋，篩選出238個(gè)可能參與離體苗再生的候選基因。
　　 1.1.2發(fā)生啟動(dòng)子DNA甲基化的候選基因篩選
　　 Methprimer軟件分析表明:在上述238候

6、選基因中，28個(gè)基因啟動(dòng)子存在密集的CG島，推測(cè)它們可能發(fā)生DNA甲基化。對(duì)它們?cè)贒NA甲基轉(zhuǎn)移酶基因敲除系（met1、cmt3、drm2和ddm1）及Col-0培養(yǎng)物中的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，20個(gè)基因在1或2個(gè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因敲除系培養(yǎng)物中表達(dá)上調(diào)，推測(cè)其表達(dá)可能受DNA甲基化調(diào)控。
　　 1.1.3候選基因啟動(dòng)子在RC及NRC中DNA甲基化狀態(tài)分析
　　 1)候選基因啟動(dòng)子DNA甲基化位點(diǎn)及水平分析:BSP(Bisul

7、fitesequencingPCR)分析發(fā)現(xiàn)，在20個(gè)候選基因中，6個(gè)基因（SRF、MAX3、TFL1、ACC1、At2g05520和At5g55450）啟動(dòng)子發(fā)生了不同位點(diǎn)的甲基化修飾。它們的DNA甲基化水平在RC和NRC中存在明顯的差異，SRF在NRC中DNA甲基化水平低，而其它基因在RC中甲基化水平低。
　　 2)候選基因的DNA甲基化模式分析:上述6個(gè)基因的DNA甲基化修飾既有對(duì)稱的CG和CNG類型，又有非對(duì)稱性的CHH

8、類型。SRF啟動(dòng)子甲基化主要發(fā)生在CG位點(diǎn)，CNG及CHH位點(diǎn)幾乎未發(fā)生甲基化。其它基因啟動(dòng)子甲基化在CG、CNG、CHH位點(diǎn)均有發(fā)生。
　　 1.1.4候選基因DNA甲基化與表達(dá)的關(guān)系分析
　　 上述基因中，SRF、ACC1、MAX3、TFL1和At2g055520的甲基化水平與其表達(dá)水平存在明顯的負(fù)相關(guān)性。SR在RC中發(fā)生超甲基化，表達(dá)下調(diào);相反，ACC1、MAX3、TFL1和At2g055520在NRC中發(fā)生超甲基

9、化，表達(dá)下調(diào)。
　　 1.1.5候選基因在甲基轉(zhuǎn)移酶基因敲除系培養(yǎng)物中的表達(dá)及甲基化狀態(tài)分析
　　 對(duì)上述基因啟動(dòng)子在不同DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因敲除系培養(yǎng)物中的甲基化狀態(tài)及其表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn)，與Col-0培養(yǎng)物相比，SRF和TFL1在met1、ddm1培養(yǎng)物中發(fā)生去甲基化、表達(dá)上調(diào);At2g055520在cmt3培養(yǎng)物中去甲基化、表達(dá)上調(diào);ACC1、MAX3和At5g55450甲基化水平均未改變，但ACC1、MAX3在me

10、t1、cmt3和ddm1表達(dá)水平上調(diào);At5g55450表達(dá)僅在drm2中上調(diào)。表明，SRF和TFL1表達(dá)受MET1和DDM1的調(diào)控，At2g055520表達(dá)僅受CMT3調(diào)控。
　　 1.1.6候選基因的組蛋白修飾及其與甲基化的關(guān)系分析
　　 ChIP分析表明，SRF在RC中發(fā)生高水平的H3K9me2和低水平的H3K9ac修飾;而ACC1、TFL1、MAX3在NRC中發(fā)生高水平的H3K9me2和低水平的H3K9ac修飾。

11、推測(cè)上述基因除發(fā)生DNA甲基化外，亦可能發(fā)生組蛋白H3K9甲基化及乙?；揎?。
　　 1.2啟動(dòng)子DNA甲基化在離體苗再生中的作用及其分子機(jī)制研究
　　 1.2.1候選基因突變體離體苗再生能力鑒定
　　 對(duì)SRF去甲基化（上調(diào)表達(dá)）突變體（srf-1、srf-2）及ACC1、MAX3、TFL1和At2g055520功能缺失突變體的離體苗再生能力分析表明，srf-1、srf-2的離體苗再生能力明顯低于Col-0，而

12、acc1-1、max3-9、tfl1-1和At2g055520敲除系的離體苗再生能力與Col-0相近，表明SRF的去甲基化降低了離體苗再生能力。
　　 1.2.2SRF調(diào)控離體苗再生能力的可能機(jī)制
　　 1.2.2.1SRF調(diào)控的相關(guān)候選基因篩選
　　 1)RT-PCR及qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，WOX9、WOX8、WOX2、WUS及PIN1在srf-1和srf-2培養(yǎng)物中表達(dá)水平明顯低于Col-0。
　　

13、 2)對(duì)WOX9::GUS、srf-2XWOX9::GUS、WUS::GUS、srf-2XWUS::GUS轉(zhuǎn)基因植株培養(yǎng)物的GUS染色分析發(fā)現(xiàn)，在srf-2培養(yǎng)物中，WOX9和WUS的表達(dá)水平明顯低于野生型。表明，SRF可能通過抑制WOX9和WUS表達(dá)來降低srf-2的離體苗再生能力。
　　 1.2.2.2與SRF直接結(jié)合的下游目標(biāo)基因的篩選
　　 1)ChIP分析表明，SRF與WOX9啟動(dòng)子結(jié)合，而不與WOX8、WOX

14、2、WUS及PIN1啟動(dòng)子結(jié)合，表明，SRF可能通過直接結(jié)合WOX9啟動(dòng)子來抑制其轉(zhuǎn)錄.
　　 2)ChIP-sequencing分析表明，約20個(gè)基因片段表現(xiàn)出高水平的測(cè)序豐度，推測(cè)SRF可能與它們直接結(jié)合。
　　 1.2.2.3WOX9敲除系wox9-1/2抑制離體苗再生
　　 對(duì)wox9-1和wox9-2離體苗再生能力分析發(fā)現(xiàn)，在LSIM（離體苗再生的液體培養(yǎng)體系）中，wox9-1和wox9-2的離體苗再生

15、能力明顯低于野生型Col-0。
　　 1.2.2.4非胚性愈傷組織(NRC)再生能力的部分恢復(fù)
　　 1)將RNAi載體pK7GWIWG-SRF轉(zhuǎn)入非胚性愈傷組織（NRC）中，經(jīng)Kan篩選及分化培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因NRC結(jié)構(gòu)變致密，表面長(zhǎng)出綠色的苗狀突起，非轉(zhuǎn)基因NRC保持原來的松散狀態(tài)，未形成突起結(jié)構(gòu)，表明轉(zhuǎn)基因NRC離體苗再生能力獲得了部分恢復(fù)。
　　 2)RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，WOX9、WOX8、WOX2、WU

16、S及PIN1表達(dá)在轉(zhuǎn)基因NRC中明顯高于非轉(zhuǎn)基因NRC，表明其上調(diào)表達(dá)可能促進(jìn)了NRC再生能力的恢復(fù)。
　　 2.大豆鹽誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子基因在NaCl處理過程中的DNA甲基化及組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)變化
　　 2.1鹽誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子基因的篩選及驗(yàn)證
　　 1)對(duì)大豆在鹽及非鹽脅迫下的基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，49個(gè)（15個(gè)GmMYBs、9個(gè)GmNACs、16個(gè)GmAP2/DREBs和9個(gè)Gmb-ZIPs）基因在鹽脅迫下表達(dá)明顯上調(diào)

17、，表明它們表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)。
　　 2)對(duì)上述基因在NaCl處理不同時(shí)間大豆中的表達(dá)水平進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明，45個(gè)基因(14個(gè)GmMYBs、8個(gè)GmNACs、8個(gè)Gmb-ZIPs和15個(gè)GmAP2/DREBs)表達(dá)上調(diào)。
　　 2.2發(fā)生DNA甲基化的候選基因的篩選
　　 對(duì)上述鹽誘導(dǎo)基因在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-ADC處理的大豆中的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，10個(gè)候選基因表達(dá)在5-ADC處理下明顯上調(diào)，推

18、測(cè)它們的表達(dá)可能受DNA甲基化的調(diào)控。
　　 2.3候選基因在NaCl處理不同時(shí)間大豆中的甲基化狀態(tài)分析
　　 1)對(duì)候選基因的甲基化狀態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，4個(gè)基因(Glma11g02400、Glma16g27950、Glma20g30840、Glma08g41450)啟動(dòng)子在NaCl處理的大豆中均發(fā)生了DNA甲基化，它們的甲基化位點(diǎn)和模式呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)的變化。
　　 2)利用Southern-blot分析了上述候選基因在鹽

19、脅迫過程中的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)它們的甲基化位點(diǎn)、水平及模式變化與BSP結(jié)果基本一致。
　　 3)基因表達(dá)水平與甲基化水平相關(guān)性分析表明，隨著NaCl處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Glma11g02400、Glma16g27950和Glma20g30840的轉(zhuǎn)錄水平與甲基化水平存在明顯的負(fù)相關(guān)性，而Glma08g41450表達(dá)水平與甲基化水平無關(guān)。
　　 2.4候選基因在甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(5-ADC)處理大豆中的甲基化狀態(tài)分析
　　

20、 1)對(duì)上述候選基因在甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(5-ADC)處理不同時(shí)間的大豆中的甲基化狀態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，Glyma11g02400、Glyma16g27950、Glyma20g30840和Glyma08g41450啟動(dòng)子在對(duì)照中均發(fā)生DNA超甲基化，在5-ADC處理48h后，啟動(dòng)子的甲基化水平逐漸降低。
　　 2)利用Southern-blot對(duì)上述基因在5-ADC處理過程中的甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它們的甲基化狀態(tài)變化與BSP結(jié)果基本

21、一致。
　　 2.5候選基因子在NaCl處理不同時(shí)間大豆中的組蛋白修飾狀態(tài)分析
　　 ChIP分析發(fā)現(xiàn)，上述候選基因的H3K9me2、H3K9ac和H3K4me3修飾水平在對(duì)照和NaCl處理1h、3h、6h、12h和24h中存在明顯的差異。在NaCl處理過程中，Glyma1lg02400、Glyma20g30840和Glyma08g41450的H3K9me2修飾水平明顯降低。Glyma20g30840和Glyma08g4