啟動(dòng)子甲基化對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼RNA在早期肝癌中的表達(dá)調(diào)控及功能研究.pdf

1、本文從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述。
　　第一部分 肝癌相關(guān)啟動(dòng)子高甲基化lncRNA的篩選
　　目的:表觀遺傳學(xué)改變是肝癌發(fā)生發(fā)展的重要原因，啟動(dòng)子甲基化程度與基因表達(dá)水平高低密切相關(guān)。LncRNA表達(dá)譜芯片目前已被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用，而lncRNA啟動(dòng)子區(qū)域甲基化研究近年才開展。本部分研究通過(guò)聯(lián)合lncRNA表達(dá)譜芯片及啟動(dòng)子芯片，旨在篩選在乙肝相關(guān)性肝癌早期患者肝癌組織及癌旁組織中存在差異表達(dá)，并且啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化的特異性lnc

2、RNA。
　　方法:本研究中采用美國(guó)Arraystar公司Human LncRNA Microarray v2.0表達(dá)譜芯片和Human2.1M LncRNA Promoter Microarray啟動(dòng)子芯片，對(duì)2011年10月-12月期間在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院就診，最終確診為乙肝相關(guān)性早期肝細(xì)胞性肝癌的8例患者的肝癌組織和癌旁組織樣本進(jìn)行檢測(cè)。表達(dá)譜芯片涵蓋了通過(guò)從世界上最權(quán)威的數(shù)據(jù)庫(kù)如RefSeq，UCSC Knowngene

3、s，Ensembl等仔細(xì)挑選出33，045條lncRNA及30，215條mRNA，在待測(cè)肝癌及癌旁組織中逐一篩選;同時(shí)，啟動(dòng)子芯片對(duì)以上lncRNA啟動(dòng)子區(qū)域（轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-3500 bp到+1250bp區(qū)域內(nèi)）進(jìn)行檢測(cè)。為了避免技術(shù)變異性導(dǎo)致的數(shù)據(jù)誤差，并精確評(píng)估樣本間甲基化差異，lncRNA啟動(dòng)子芯片初步結(jié)果通過(guò)中位數(shù)對(duì)齊、分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化和線性平滑等分析手段進(jìn)行校正。為了進(jìn)一步精確量化CpG甲基化水平，我們應(yīng)用一種新的分析手段——ME

4、DME(modeling experimental data with MeDIP enrichment)。MEDME利用絕對(duì)甲基化分?jǐn)?shù)(absolute methylation score，AMS)篩選樣本間lncRNA啟動(dòng)子差異性甲基化區(qū)域(differentially methylated region，DMR)。組間差異性甲基化測(cè)定通過(guò)AMS結(jié)果的t檢驗(yàn)，P＜0.05，AMS差值A(chǔ)BS(AMS_dif)大于8，定義為為候選DMR

5、。然后再對(duì)候選DMR的AMS均值用t檢驗(yàn)進(jìn)行再次評(píng)估和檢測(cè)，DMR內(nèi)AMS的均值在兩組間仍然具有顯著差異則最終被選定。通過(guò)結(jié)合兩種芯片的分析結(jié)果，挑選在肝癌及癌旁組織中表達(dá)水平存在差異表達(dá)，且啟動(dòng)子區(qū)域CpG島高甲基化的肝癌特異性lncRNA。
　　結(jié)論:lncRNA表達(dá)譜芯片是目前篩選肝癌相關(guān)lncRNA的常用手段，lncRNA啟動(dòng)子芯片能夠靈敏高效的測(cè)定啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平。通過(guò)結(jié)合兩種芯片的優(yōu)勢(shì)，能夠有效的篩選潛在的受啟動(dòng)

6、子甲基化水平調(diào)控的肝癌特異性lncRNA，為之后進(jìn)一步的驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分 肝癌相關(guān)啟動(dòng)子高甲基化lncRNA的驗(yàn)證
　　目的:LncRNA芯片的出現(xiàn)為肝癌相關(guān)lncRNA的篩選提供了高效的平臺(tái)，具有全面覆蓋、高效、高靈敏性等特點(diǎn)，但是由于芯片檢測(cè)易受干擾，造成芯片結(jié)果不穩(wěn)定。本部分研究旨在對(duì)前期篩選的22個(gè)候選lncRNA在肝癌、癌旁組織中的表達(dá)水平及啟動(dòng)子甲基化進(jìn)一步驗(yàn)證，確定啟動(dòng)子甲基化調(diào)控的肝癌特異性ln

7、cRNA。
　　方法:依據(jù)第一部分芯片篩選的結(jié)果，在選送芯片的8例肝癌患者腫瘤及癌旁組織中用Real-Time PCR的方法驗(yàn)證差異表達(dá)的lncRNA，并用甲基化特異性PCR反應(yīng)(Methylation specific PCR，MSP)聯(lián)合亞硫酸氫鹽修飾結(jié)合測(cè)序法(Bisulphitemodification combining sequencing PCR，BSP)驗(yàn)證其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。為了進(jìn)一步核實(shí)候選lncRNA，剔除假

8、陽(yáng)性，我們?cè)O(shè)立另一個(gè)獨(dú)立樣本組，來(lái)自中山醫(yī)院肝外科2009年的30例早期肝癌及癌旁標(biāo)本，利用MSP驗(yàn)證候選lncRNA啟動(dòng)子甲基化水平;此外，我們?cè)?0例基礎(chǔ)上增加24例早期肝癌樣本利用Real-Time PCR擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證候選lncRNA在肝癌和癌旁組織中的表達(dá)差異。
　　結(jié)論:經(jīng)過(guò)本部分兩次驗(yàn)證表明，22個(gè)候選lncRNA在初步驗(yàn)證中有90.9％(20of22)在肝癌組織中表達(dá)下調(diào);擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證證實(shí)表達(dá)下調(diào)的lncRNA占

9、100％(22 of22)。而通過(guò)BSP、 MSP兩次驗(yàn)證的13個(gè)lncRNA，啟動(dòng)子區(qū)域在肝癌組織中均呈不同程度的高甲基化。由此可見，應(yīng)用lncRNA表達(dá)譜芯片和啟動(dòng)子甲基化芯片篩選肝癌相關(guān)啟動(dòng)子高甲基化的lncRNA結(jié)果是穩(wěn)定可靠的。
　　第三部分 啟動(dòng)子甲基化對(duì)lncRNA-SCARF1在肝癌中的表達(dá)調(diào)控及功能研究
　　目的:根據(jù)前期研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)lncRNA-SCARF1是一個(gè)啟動(dòng)子高度甲基化，在肝癌組織中表達(dá)水

10、平顯著下調(diào)的lncRNA，推測(cè)其可能在肝癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用。本部分研究旨在肝癌細(xì)胞株、肝癌及癌旁組織中進(jìn)一步探討啟動(dòng)子甲基化對(duì)lncRNA-SCAR11的調(diào)控，初步了解lncRNA對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展的影響、潛在通路及臨床意義。
　　方法:運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)lncRNA-SCARF1在肝癌細(xì)胞株HepG2、Huh7、SMMC-7721、MHCC-97L、MHCC-97H、MHCC-LM3及正常肝細(xì)胞L02中的表達(dá)情況。通過(guò)甲基化

11、抑制劑5-氮雜脫氧胞苷酸(5-aza-deoxycytidine，5’-Aza-dc)檢測(cè)干預(yù)前后lncRNA-SCARF1表達(dá)水平的改變，同時(shí)采用BSP和MSP驗(yàn)證其啟動(dòng)子甲基化水平的改變。應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)過(guò)表達(dá)lncRNA-SCARF1，研究其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲能力的影響;通過(guò)裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)成瘤能力的作用。通過(guò)芯片預(yù)測(cè)以及最新的PCR基因信號(hào)通路芯片篩選lncRNA-SCARF1的潛在靶基因，并通過(guò)qRT-PCR