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文檔簡介
1、本文從以下幾個方面進行論述。
第一部分 肝癌相關啟動子高甲基化lncRNA的篩選
目的:表觀遺傳學改變是肝癌發(fā)生發(fā)展的重要原因,啟動子甲基化程度與基因表達水平高低密切相關。LncRNA表達譜芯片目前已被國內外廣泛應用,而lncRNA啟動子區(qū)域甲基化研究近年才開展。本部分研究通過聯(lián)合lncRNA表達譜芯片及啟動子芯片,旨在篩選在乙肝相關性肝癌早期患者肝癌組織及癌旁組織中存在差異表達,并且啟動子區(qū)域高甲基化的特異性lnc
2、RNA。
方法:本研究中采用美國Arraystar公司Human LncRNA Microarray v2.0表達譜芯片和Human2.1M LncRNA Promoter Microarray啟動子芯片,對2011年10月-12月期間在復旦大學附屬中山醫(yī)院就診,最終確診為乙肝相關性早期肝細胞性肝癌的8例患者的肝癌組織和癌旁組織樣本進行檢測。表達譜芯片涵蓋了通過從世界上最權威的數(shù)據庫如RefSeq,UCSC Knowngene
3、s,Ensembl等仔細挑選出33,045條lncRNA及30,215條mRNA,在待測肝癌及癌旁組織中逐一篩選;同時,啟動子芯片對以上lncRNA啟動子區(qū)域(轉錄起始位點-3500 bp到+1250bp區(qū)域內)進行檢測。為了避免技術變異性導致的數(shù)據誤差,并精確評估樣本間甲基化差異,lncRNA啟動子芯片初步結果通過中位數(shù)對齊、分位數(shù)標準化和線性平滑等分析手段進行校正。為了進一步精確量化CpG甲基化水平,我們應用一種新的分析手段——ME
4、DME(modeling experimental data with MeDIP enrichment)。MEDME利用絕對甲基化分數(shù)(absolute methylation score,AMS)篩選樣本間lncRNA啟動子差異性甲基化區(qū)域(differentially methylated region,DMR)。組間差異性甲基化測定通過AMS結果的t檢驗,P<0.05,AMS差值ABS(AMS_dif)大于8,定義為為候選DMR
5、。然后再對候選DMR的AMS均值用t檢驗進行再次評估和檢測,DMR內AMS的均值在兩組間仍然具有顯著差異則最終被選定。通過結合兩種芯片的分析結果,挑選在肝癌及癌旁組織中表達水平存在差異表達,且啟動子區(qū)域CpG島高甲基化的肝癌特異性lncRNA。
結論:lncRNA表達譜芯片是目前篩選肝癌相關lncRNA的常用手段,lncRNA啟動子芯片能夠靈敏高效的測定啟動子區(qū)域的甲基化水平。通過結合兩種芯片的優(yōu)勢,能夠有效的篩選潛在的受啟動
6、子甲基化水平調控的肝癌特異性lncRNA,為之后進一步的驗證奠定了基礎。
第二部分 肝癌相關啟動子高甲基化lncRNA的驗證
目的:LncRNA芯片的出現(xiàn)為肝癌相關lncRNA的篩選提供了高效的平臺,具有全面覆蓋、高效、高靈敏性等特點,但是由于芯片檢測易受干擾,造成芯片結果不穩(wěn)定。本部分研究旨在對前期篩選的22個候選lncRNA在肝癌、癌旁組織中的表達水平及啟動子甲基化進一步驗證,確定啟動子甲基化調控的肝癌特異性ln
7、cRNA。
方法:依據第一部分芯片篩選的結果,在選送芯片的8例肝癌患者腫瘤及癌旁組織中用Real-Time PCR的方法驗證差異表達的lncRNA,并用甲基化特異性PCR反應(Methylation specific PCR,MSP)聯(lián)合亞硫酸氫鹽修飾結合測序法(Bisulphitemodification combining sequencing PCR,BSP)驗證其啟動子甲基化狀態(tài)。為了進一步核實候選lncRNA,剔除假
8、陽性,我們設立另一個獨立樣本組,來自中山醫(yī)院肝外科2009年的30例早期肝癌及癌旁標本,利用MSP驗證候選lncRNA啟動子甲基化水平;此外,我們在30例基礎上增加24例早期肝癌樣本利用Real-Time PCR擴大樣本量驗證候選lncRNA在肝癌和癌旁組織中的表達差異。
結論:經過本部分兩次驗證表明,22個候選lncRNA在初步驗證中有90.9%(20of22)在肝癌組織中表達下調;擴大樣本量驗證證實表達下調的lncRNA占
9、100%(22 of22)。而通過BSP、 MSP兩次驗證的13個lncRNA,啟動子區(qū)域在肝癌組織中均呈不同程度的高甲基化。由此可見,應用lncRNA表達譜芯片和啟動子甲基化芯片篩選肝癌相關啟動子高甲基化的lncRNA結果是穩(wěn)定可靠的。
第三部分 啟動子甲基化對lncRNA-SCARF1在肝癌中的表達調控及功能研究
目的:根據前期研究結果,我們發(fā)現(xiàn)lncRNA-SCARF1是一個啟動子高度甲基化,在肝癌組織中表達水
10、平顯著下調的lncRNA,推測其可能在肝癌細胞中發(fā)揮抑癌作用。本部分研究旨在肝癌細胞株、肝癌及癌旁組織中進一步探討啟動子甲基化對lncRNA-SCAR11的調控,初步了解lncRNA對肝癌的發(fā)生發(fā)展的影響、潛在通路及臨床意義。
方法:運用qRT-PCR檢測lncRNA-SCARF1在肝癌細胞株HepG2、Huh7、SMMC-7721、MHCC-97L、MHCC-97H、MHCC-LM3及正常肝細胞L02中的表達情況。通過甲基化
11、抑制劑5-氮雜脫氧胞苷酸(5-aza-deoxycytidine,5’-Aza-dc)檢測干預前后lncRNA-SCARF1表達水平的改變,同時采用BSP和MSP驗證其啟動子甲基化水平的改變。應用慢病毒轉染技術過表達lncRNA-SCARF1,研究其對肝癌細胞增殖、凋亡、侵襲能力的影響;通過裸鼠皮下成瘤實驗觀察其對成瘤能力的作用。通過芯片預測以及最新的PCR基因信號通路芯片篩選lncRNA-SCARF1的潛在靶基因,并通過qRT-PCR
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