擬南芥miR159及其靶基因調(diào)控離體苗再生的作用研究.pdf

1、植物離體器官誘導(dǎo)是目前植物干細(xì)胞領(lǐng)域的一個研究熱點，指植物外植體材料（包括根、下胚軸、子葉及種子等）在適宜的離體培養(yǎng)環(huán)境中誘導(dǎo)離體苗、根等器官形成的生物學(xué)過程。目前，植物離體器官的再生體系相對成熟，一般包括愈傷組織形成和離體苗分化兩個過程。研究人員在此基礎(chǔ)上發(fā)掘了一些調(diào)控愈傷組織形成和離體器官再生的相關(guān)基因，然而離體器官再生的調(diào)控機制仍不清楚，尤其是表觀遺傳調(diào)控子在植物離體器官再生中的功能有待系統(tǒng)研究。
　　MicroRNAs(m

2、iRNAs)作為小分子非編碼RNA，主要通過轉(zhuǎn)錄后水平剪切抑制靶基因的表達(dá)或翻譯，進而表觀調(diào)控植物的形態(tài)建成及逆境脅迫響應(yīng)等生物學(xué)過程。目前，部分研究揭示了miRNAs參與調(diào)控植物的離體苗再生，進而揭開了植物離體器官再生過程中miRNAs的功能研究，因而，為了解析miRNAs在離體苗再生中的調(diào)控機制，更多的功能miRNAs有待挖掘。
　　本實驗室前期通過分析擬南芥胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織miRNAs的表達(dá)譜芯片，發(fā)現(xiàn)miR15

3、9、miR165/6在兩類愈傷組織中表達(dá)差異明顯，推測其在離體苗再生中起作用。
　　本論文利用mir159ab雙突變體材料，分析了miR159在離體苗誘導(dǎo)過程中的功能，并進一步明確了miR159調(diào)控愈傷組織形成和離體苗再生過程中的靶基因。鑒于離體器官誘導(dǎo)所用外植體為擬南芥的根，因而進一步開展了miR159對擬南芥主根生長及根尖分生組織區(qū)發(fā)育的調(diào)控研究。另外，miRNAs對靶基因的表觀調(diào)控離不開AGO家族蛋白的參與，而AGO10可與

4、AGO1競爭結(jié)合miR165/6進而減少沉默復(fù)合體的形成，因此本論文擬開展miR165/6及其調(diào)控子AGO10在離體苗誘導(dǎo)過程中的功能，并對其調(diào)控離體苗再生的機制進行了初步研究。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1)mir159ab雙突變體根外植體形成的愈傷組織團數(shù)目明顯增多，Real-time PCR分析表明，MYB33、MYB65和MYB101在mir159ab的CIM培養(yǎng)物中表達(dá)均顯著提升。通過比較pMYB65:159-G

5、FP和mir159ab×pMYB65:159-GFP株系外植體在CIM培養(yǎng)階段的GFP信號，發(fā)現(xiàn)mir159ab×pMYB65:159-GFP外植體誘導(dǎo)的愈傷組織中GFP信號顯著增強，進一步證明了愈傷組織形成過程中miR159對MYB65表達(dá)的抑制模式。分析MYB65的抗剪切系pMYB65:mMYB65及myb33myb65myb101三突變體的愈傷組織形成能力，發(fā)現(xiàn)pMYB65:mMYB65形成的愈傷組織團數(shù)目顯著提升，而myb33m

6、yb65myb101三突變體形成的愈傷組織數(shù)目明顯減少。結(jié)果表明miR159通過抑制靶基因MYB33、MYB65和MYB101的表達(dá)抑制CIM階段愈傷組織的形成。
　　2)mir159ab雙突變體根外植體離體苗分化的數(shù)目明顯減少，Real-time PCR分析表明，MYB33、MYB65和MYB101在mir159ab的SIM培養(yǎng)物中的表達(dá)均顯著提升。通過比較pMYB6:159-GFP和mir159ab×pMYB65:159-GF

7、P株系外植體在SIM培養(yǎng)4-10d的GFP信號，發(fā)現(xiàn)mir159ab×pMYB65:159-GFP外植體形成的細(xì)胞團中GFP信號顯著增強，進一步證明了離體苗再生過程中miR159對MYB65表達(dá)的抑制模式。分析pMYB33:mMYB33、pMYB65:mMYB65、pMYB101:mMYB101（靶基因MYB33/65/101的抗剪切系)及myb33myb65myb101三突變體的離體苗再生表型，發(fā)現(xiàn)3個靶基因的抗剪切系的離體苗再生數(shù)目

8、均顯著減少，而靶基因的三突變體的離體苗再生數(shù)目未見顯著變化，表明MYB33、MYB65和MYB101均抑制離體苗的再生。Real-time PCR分析表明，WUS、CLV3和STM在pMYB65:mMYB65系SIM培養(yǎng)物中的表達(dá)均顯著降低。GFP信號檢測表明pTCSn:GFP信號在pMYB65:mMYB65系SIM培養(yǎng)物中減弱，而pDR5:GFP信號增強。上述結(jié)果表明miR159為離體苗再生的促進子，通過抑制靶基因(MYB33、MYB

9、65和MYB101)的表達(dá)，進而促進WUS、CLV3和STM的表達(dá)和細(xì)胞分裂素的響應(yīng)并降低生長素信號響應(yīng)實現(xiàn)對離體苗再生的表觀調(diào)控。
　　3)mir159ab雙突變體的主根長度及其根尖分生組織區(qū)大小顯著高于野生型。Real-time PCR分析表明，MYB33、MYB65和MYB101在mir159ab主根中的表達(dá)量顯著增強，同時pMYB33:mMYB33、pMYB65:mMYB65和pMYB101:mMYB101系的主根長度明顯

10、增加，表明miR159通過抑制靶基因的表達(dá)進而抑制擬南芥主根的生長。通過檢測pMYB65:mMYB65×pCYCB1;1:GUS、pMYB65:mMYB65×pPIN1:PIN1-GFP、pMYB65:mMYB65×pWOX5:GFP、pMYB65:mMYB65×pPLT1:PLT1-GFP和pMYB65:mMYB65×pSCR:GFP株系的GUS及GFP信號，發(fā)現(xiàn)MYB65促進CYCB1;1的表達(dá)，EMSA實驗進一步證明MYB65可直

11、接結(jié)合促進CYCB1;1基因的表達(dá)進而促進根尖分生組織區(qū)細(xì)胞的分裂，并促進主根的生長。
　　4)利用實驗室建立的成熟種子的液體誘導(dǎo)體系分析了AGO10在離體苗再生中的功能。發(fā)現(xiàn)p35S:AGO10離體苗再生比率低于野生型，而ago10（功能缺失突變體）離體苗再生比率顯著升高，同時p35S:AGO10轉(zhuǎn)化ago10可明顯降低其離體苗再生頻率，表明AGO10為離體苗再生的抑制子。通過觀察離體苗再生過程中pAGO10:GUS及pAGO1

12、0:GFP報告基因的信號，發(fā)現(xiàn)AGO10表達(dá)于形成的突起結(jié)構(gòu)及原分生組織(pro-SAM)的起始部位。通過比較離體苗再生過程中，pU2:MIR165/6-GFP在野生型與ago10中的GFP信號，發(fā)現(xiàn)ago10×pU2:MIR165/6-GFP的培養(yǎng)物中GFP信號顯著降低，表明miR165/6在ago10中的表達(dá)明顯增強。RNA原位雜交結(jié)果顯示，AGO10表達(dá)部位集中于突起結(jié)構(gòu)的pro-SAM部位，并與miR165/6的表達(dá)部位重疊，抑

13、制miR165/6的表達(dá)，從而促進HD-ZIPⅢ的表達(dá)。分析MIM165/6(artificial miR165/6target mimics)及men1(miR166a-ox)的離體苗再生表型，發(fā)現(xiàn)MIM165/166的離體苗再生頻率降低而men1的離體苗再生頻率增高，表明miR165/166為離體苗再生的促進子。進一步分析ago10×MIM165/6雜交系的表型，發(fā)現(xiàn)ago10×MIM166的離體苗再生數(shù)目顯著低于ago10外植體分