miR-23a及其靶基因APAF-1在喉癌中的作用和功能研究.pdf

1、目的：
　　喉癌是全世界范圍內最常見也是致死率最高的頭頸部腫瘤之一，發(fā)病率約占全身腫瘤的1％～5％。流行病學資料顯示，喉癌在男性中高發(fā)，發(fā)病人群的年齡多在40歲以上，且90％以上的喉癌其臨床病理學分型為喉鱗狀細胞癌。盡管喉癌在早期診斷與治療手段方面取得了許多進步，但近幾十年來喉癌患者的五年生存率幾乎沒有任何變化，其中很重要的原因在于喉癌的早期癥狀不明顯，缺乏可靠的喉癌早期診斷生物標記物。因此，喉癌發(fā)生發(fā)展的分子機制研究將有助于發(fā)現

2、喉癌早期診治、預后判定的新生物學標志物，為喉癌早期診斷和靶向治療提供科學依據。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一類由19-24個核苷酸組成的內源非編碼單鏈小RNA，屬于非編碼RNA家族的重要成員，是近年來生命科學領域研究的熱點。研究表明，在惡性腫瘤中普遍存在miRNAs的異常表達，且不同惡性腫瘤miRNAs差異性表達譜也不盡相同。此外，miRNAs表達水平與腫瘤患者原發(fā)腫瘤的侵襲范圍、病理分型、分化程度、淋巴結轉移、外科

3、治療和放化療的治療效果及術后生存時間均密切相關。因此，miRNA已成為腫瘤發(fā)生、發(fā)展與預后判定的重要分子標記物。
　　MiR-23a基因是miR-23a/27a/24-2基因簇家族成員，位于19p13.12染色體上。我們課題組前期研究發(fā)現miR-24-2在喉癌中異常表達，參與喉癌細胞的增殖和凋亡調節(jié)，因此，推測處于同一基因簇的miR-23a也會在喉癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。
　　凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotic p

4、rotease activating factor-1，APAF-1)是線粒體凋亡途徑的重要調節(jié)子，在惡性腫瘤中處于失活或者“靜默”狀態(tài)，發(fā)揮抑癌基因作用。通過生物信息學軟件預測，發(fā)現APAF-1是miR-23a的潛在靶點之一。因此，筆者推測miR-23靶向APAF-1參與喉癌的發(fā)生和發(fā)展。
　　本研究將以喉癌為研究對象，應用相關分子生物學技術探討miR-23a和APAF-1在喉癌中的作用和臨床意義，鑒定miR-23a的潛在靶基因

5、APAF-1，明確miR-23a是否通過APAF-1參與喉癌細胞增殖、凋亡等過程，為以miR-23a為喉癌診治和預后分子靶標的深入研究奠定理論基礎。
　　方法：
　　1、中國人民解放軍463醫(yī)院耳鼻喉科提供喉癌組織及相應配對的癌旁正常組織標本，均為手術后剩余組織，組織標本的使用經中國醫(yī)科大學倫理委員會批準并獲得患者的知情同意。同時，獲得患者喉癌組織病理類型、就診和治療經過以及術后生存情況的完整病歷信息。
　　2、通過熒

6、光定量RT-PCR技術(Real-Time PCR)檢測喉癌組織及相應癌旁組織中miR-23a及APAF-1基因mRNA表達水平，應用Western blot進一步檢測APAF-1蛋白表達水平，并對二者表達水平進行相關性分析。
　　3、通過熒光素酶報告基因檢測方法鑒定miR-23a與APAF-1 mRNA的3'UTR特異性結合能力。將miR-23a基因的模擬物和抑制物轉染喉癌Hep-2細胞中，檢測APAF-1表達的變化情況，進一步

7、明確miR-23a在喉癌中對APAF-1表達的調控作用。
　　4、將miR-23a基因和siAPAF-1相關短片段分別轉染喉癌Hep-2細胞，應用MTT法、流式細胞術、克隆形成實驗、Transwells小室及基質膠侵襲實驗檢測轉染前后喉癌細胞增殖速率、凋亡率、克隆形成能力、遷移及侵襲能力的變化情況，評估m(xù)iR-23a和APAF-1對喉癌生物學行為的影響。
　　5、應用單因素方差分析、Kaplan-Meier生存曲線和Cox回

8、歸模型的統(tǒng)計方法分析miR-23a基因與喉癌患者臨床病理學特點和生存時間的相關性。應用SPSS16.0對本實驗所有數據進行統(tǒng)計分析，配對樣本t檢驗用于兩組數據之間的比較分析。
　　結果：
　　1、Real-Time PCR和Western blot檢測結果表明，喉癌組織miR-23a表達水平較癌旁正常組織顯著升高(P＜0.05)，APAF-1 mRNA和蛋白表達水平較癌旁正常組織顯著下降(P＜0.05)，二者表達呈負相關關系

9、(R=-0.697，P=0.025; R=-0.633,P=0.049)。
　　2、單因素方差分析結果顯示，在有淋巴結轉移和高級別臨床分期（Ⅲ和Ⅳ期）的喉癌患者組織中，miR-23a表達顯著上調(P＜0.05)，但在不同年齡、性別、吸煙、飲酒、分化和腫瘤浸潤深度亞組中未發(fā)現表達差異。
　　3、Kaplan-Meier生存曲線顯示，miR-23a高表達組的喉癌患者五年生存率較miR-23a低表達組顯著降低（秩和檢驗P=0.00

10、3）。多因素Cox回歸分析結果顯示，miR-23a表達水平與喉癌患者臨床分期同為喉癌患者預后的主要獨立危險因素(P=0.001; P=0.001)。
　　4、共同轉染APAF-13'非翻譯區(qū)熒光素酶載體及miR-23a模擬物至HEK293細胞中，結果顯示共轉染組熒光素酶活性顯著低于對照組(P＜0.05)，提示miR-23a可與APAF-13'非翻譯區(qū)結合。此外，Western Blot及Real-Time PCR結果表明miR-2

11、3a能夠顯著降低Hep-2細胞中APAF-1 mRNA及蛋白水平(P＜0.05)，且與siAPAF-1效果一致，進一步證實miR-23a通過與APAF-13'非翻譯區(qū)結合下調APAF-1表達。
　　5、MTT檢測結果顯示，與正常對照組相比，轉染miR-23a模擬物組能夠顯著增加喉癌Hep-2細胞的增殖能力(P＜0.05)，而轉染miR-23a抑制物組則顯著降低喉癌Hep-2細胞的增殖能力(P＜0.05)。與轉染miR-23a模擬物

12、組效果相同，siAPAF-1組也能夠顯著增加Hep-2細胞的增殖能力(P＜0.05)。
　　6、克隆形成實驗結果顯示，與正常對照組相比，轉染miR-23a模擬物的喉癌Hep-2細胞克隆形成能力顯著提高(P＜0.05)，而轉染miR-23a抑制物的喉癌Hep-2細胞克隆形成能力則顯著降低(P＜0.05)。與轉染miR-23a模擬物組效果相同，siAPAF-1組也能夠顯著提高Hep-2細胞的克隆形成能力(P＜0.05)。
　　7

13、、流式細胞術結果顯示，與對照組相比，轉染miR-23a抑制物組喉癌Hep-2細胞凋亡率顯著升高(P＜0.05)，而轉染siAPAF-1組喉癌Hep-2細胞凋亡率顯著降低(P＜0.05)，但轉染miR-23a模擬物組喉癌Hep-2細胞凋亡率變化不明顯（P＞0.05）。
　　8、侵襲和轉移實驗結果顯示，與正常對照組組相比，轉染miR-23a模擬物組喉癌Hep-2細胞的侵襲及轉移能力顯著增加(P＜0.05)，而轉染miR-23a抑制劑組