miR-29及其靶基因COLI在增生性瘢痕形成中的作用及機制研究.pdf

1、背景：增生性瘢痕（HS）是皮膚創(chuàng)傷愈合過程中常見的并發(fā)癥，發(fā)生率高達4~16％，嚴重影響組織功能恢復和外觀。膠原的合成與降解代謝失衡是 HS形成的根本原因，但導致膠原持續(xù)過度合成的病因?qū)W與分子機制尚不十分明確，臨床上對 HS的治療是一大臨床挑戰(zhàn)。盡管采用了許多治療方法，但其治療效果卻不盡相同。因此，需要探尋新的治療靶點。在前期的研究中，基因芯片檢測顯示，正常皮膚(NS)組織和HS組織中microRNA（miRNA）分子的表達存在明顯差異

2、，這些 miRNA分子所調(diào)節(jié)的靶基因涵蓋了細胞生命活動的多個方面，如細胞凋亡與增殖、周期與運動、合成與代謝，其中miR-29的差異最明顯。而目前有研究認為，miR-29可以在轉(zhuǎn)錄后水平抑制膠原的合成，從而在多種纖維化疾病的發(fā)生中起重要的調(diào)控作用。但miR-29與HS形成關系的研究尚未見文獻報道。因此，我們推測，持續(xù)低水平表達的 miR-29喪失了對COLI基因表達的有效調(diào)控，進而導致膠原為主的細胞外基質(zhì)（ECM）的過度沉積，最終形成HS

3、。如果施用正義miR-29提高HS局部組織中miR-29表達水平，將有可能成功抑制組織的過度纖維化過程，為HS的臨床防治提供新的靶點。
　　目的：通過 miRNA表達譜芯片篩選出HS組織及NS組織中顯著差異表達的miRNA分子，探討miR-29通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其靶基因COLI表達從而影響HS形成的作用機制，以期為HS的生物學治療提供新的靶點。
　　方法：
　　1.收集HS組織和NS組織標本，經(jīng)過HE染色后證明所取臨

4、床標本符合實驗需要。分離并培養(yǎng)人 HS及 NS原代成纖維細胞。通過 miRNA基因芯片篩選出 HS及NS中差異表達的miRNA分子，并采用生物信息學方法預測 miR-29下游靶基因。
　　2.進一步使用熒光定量PCR方法及western blot法明確人NS與HS中miR-29c及COLI基因的差異性表達，并采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗進行分析，探討miR-29與COLI基因表達水平的相關性；
　　3.構(gòu)建COLI A

5、1-3’UTR及其3種突變體的重組熒光素酶報告基因載體，分析正常成纖維細胞和瘢痕成纖維細胞中 COLI A1-3’UTR熒光素酶報告載體活性是否存在顯著差異，miR-29c模擬劑是否能顯著降低報告載體的活性，從而驗證 COLI是否為miR-29c下游的有效靶基因。
　　4.構(gòu)建和包裝人 miR-29c過表達腺病毒，分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的 NS成纖維細胞及 HS成纖維細胞，采用流式細胞分析法及CCK-8法檢測HS成纖維細胞在感染腺病毒過表達

6、miR-29c后，細胞的增殖與凋亡是否受到顯著影響。
　　結(jié)果：
　　1.收集的HS和NS組織標本經(jīng)過HE染色后均證明符合實驗需要。免疫熒光染色鑒定HS組織及NS組織原代培養(yǎng)所得的細胞確實為成纖維細胞；
　　2.基因芯片技術(shù)篩選發(fā)現(xiàn)，HS組織中 miR-143、miR-32、miR-92b及 miR-25等45個miRNA的表達水平與NS組織相比上調(diào)，同時miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-713、

7、miR-195等68個miRNA顯著表達下調(diào)，提示它們可能在HS的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。其中，miR-29的改變最為顯著，在12個HS樣本中miR-29分子表達均顯著低于NS組織（平均降低15.3倍）。
　　3.熒光定量PCR方法對篩選出的miRNA-29在HS及NS組織中的表達情況進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是在組織中還是原代成纖維細胞中，miR-29c在 HS中的表達顯著低于NS組織。而miRNA-29家族的其他成員在HS/NS

8、中的表達量均無顯著差異。
　　4.應用生物信息學數(shù)據(jù)庫及軟件對miR-29靶基因進行預測，初步推測COLI是miR-29可能的靶基因。熒光定量PCR及Western Blot檢測表明COLI基因在NS組織中的表達量顯著低于HS組織，COLI在HS組織及NS組織原代培養(yǎng)所得的成纖維細胞中的表達量與組織中表達趨勢相符，卡方檢驗分析發(fā)現(xiàn)，無論在 HS及 NS組織中還是在原代培養(yǎng)的成纖維細胞中，miR-29與 COLI基因表達水平均具有顯

9、著負相關性。
　　5.構(gòu)建了 COLI基因及 miR-29c相應結(jié)合區(qū)的突變體熒光素酶報告基因載體，酶切及測序證實構(gòu)建成功。熒光素酶活性的檢測結(jié)果顯示：瘢痕成纖維細胞中，COLI A1-3’UTR熒光素酶報告載體活性顯著高于正常成纖維細胞。在正常成纖維細胞及增生性瘢痕成纖維細胞中，miR-29c模擬劑均能有效降低COLI A1-3’UTR熒光素酶報告載體活性，卻不能有效降低其突變體的熒光素酶報告載體活性。進一步說明 miR-29c

10、可直接作用于COLI A1-3’UTR從而發(fā)揮作用。
　　6.成功構(gòu)建和包裝人miR-29c過表達腺病毒后，分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的NS成纖維細胞及HS成纖維細胞，采用定量PCR結(jié)合WB檢測發(fā)現(xiàn)miR-29過表達后COLI基因表達顯著受到抑制，細胞增殖實驗及流式細胞分析發(fā)現(xiàn) miR-29過表達后成纖維細胞的增殖率顯著提高而凋亡率顯著下降。
　　結(jié)論：
　　1.基因芯片技術(shù)篩選發(fā)現(xiàn)，HS組織中 miR-143、miR-32、miR

11、-92b及miR-25等45個miRNA的表達水平與NS組織相比上調(diào)，同時miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-713、miR-195等68個miRNA顯著表達下調(diào)，提示它們可能在HS的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。其中，miR-29的表達差異最為顯著。
　　2.在無論是組織還是細胞， miR-29c在HS中的表達均顯著低于NS，降低HS成纖維細胞中miR-29c的表達可以促進其增殖并抑制其凋亡，提示miR-29在HS