非編碼RNA在人增生性瘢痕中的表達(dá)研究.pdf

1、目的:非編碼RNA(包括miRNA和lncRNA等)在基因調(diào)控中起著非常重要的作用,目前其對(duì)增生性瘢痕發(fā)病機(jī)制的影響尚不清楚。本文在前期篩選miRNA表達(dá)譜的基礎(chǔ)上,通過比較miR-21和PDCD4蛋白在增生性瘢痕和鄰近正常皮膚組織中的表達(dá),并分析其相關(guān)性,探索miR-21在增生性瘢痕組織中發(fā)生發(fā)展的作用。應(yīng)用微矩陣基因芯片技術(shù)研究lncRNA在增生性瘢痕和鄰近正常皮膚組織表達(dá)譜的變化,初步探討其生物學(xué)作用。并比較增生性瘢痕與正常皮膚組

2、織中mRNA表達(dá)譜的差異,并對(duì)差異mRNA行生物信息分析,從分子水平全面探討增生性瘢痕的發(fā)病機(jī)制,為臨床治療提供新靶點(diǎn)。
　　方法:分別取手術(shù)切除后的增生性瘢痕組織和鄰近的正常皮膚組織,采用Trizol試劑提取總RNA并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè),(1)合格后根據(jù)miRNA序列設(shè)計(jì)特異引物,采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)增生性瘢痕和正常皮膚中的miR-21基因表達(dá)量;Western blot法及免疫組化SP法檢測(cè)增生性瘢痕和正常皮膚中PDCD

3、4蛋白的表達(dá)量。(2)合格后逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA,分別與lncRNA基因芯片和mRNA基因芯片過夜雜交,計(jì)算機(jī)掃描并分析芯片熒光信號(hào)圖像,利用Genespring10.0軟件篩選表達(dá)差異基因,得到增生性瘢痕和正常皮膚組織間lncRNA和mRNA的差異表達(dá)圖譜。分別挑選上調(diào)的lncRNA2個(gè):H19、AC093850.2,下調(diào)的lncRNA2個(gè):NAMA、XIST;上調(diào)的mRNA2個(gè):EGF, SAMD2,下調(diào)的mRNA2個(gè):BAX,SAM

4、D7采用Bio-Rad熒光定量PCR儀,SYBR Green熒光染料參入法驗(yàn)證,以GAPDH作為內(nèi)參。應(yīng)用DAVID Bioinformatics Resources6.7進(jìn)行基因本體(GO)、生物學(xué)通路(Pathway)、功能注釋聚類分析,獲得差異基因相關(guān)功能的功能富集類。
　　結(jié)果:相比于正常皮膚組織,增生性瘢痕中miR-21基因的表達(dá)上調(diào),其表達(dá)量是正常皮膚組織的5.51倍,而PDCD4蛋白的表達(dá)降低(P<0.05),且mi

5、R-21與PDCD4蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.945(P<0.05)。共檢測(cè)出21617條lncRNA,將增生性瘢痕組織lncRNA的表達(dá)量與正常皮膚組織相比較,其中相對(duì)表達(dá)量比值在2倍以上,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的lncRNA作為是表達(dá)差異的lncRNA。結(jié)果相對(duì)表達(dá)量比值在2倍以上變化的共5635條,2倍以上上調(diào)的共1918條,2倍以上下調(diào)的共3717條,5倍以上上調(diào)的共12條,5倍以上下調(diào)的共15條。采用實(shí)時(shí)

6、定量PCR,以正常皮膚組織作為對(duì)照,檢測(cè)增生性瘢痕組織中4條lncRNA(H19、NAMA、AC093850.2、XIST)的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果相對(duì)于正常皮膚組織,H19、AC093850.2表達(dá)量上調(diào),NAMA、XIST表達(dá)量下調(diào),與芯片結(jié)果吻合。人增生性瘢痕與正常皮膚組織相比較,mRNA相對(duì)表達(dá)量比值在2倍以上變化的共6126條,2倍以上上調(diào)的共3142條,2倍以上下調(diào)的共2984條,5倍以上上調(diào)的共28條,5倍以上下調(diào)的共44條。采

7、用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證基因芯片結(jié)果的可靠性。挑選增生性瘢痕中4條表達(dá)差異的mRNA(BAX,SMAD2,SMAD7,EGF)進(jìn)行定量分析。結(jié)果相對(duì)于正常皮膚組織,EGF,SAMD2表達(dá)量上調(diào),BAX,SAMD7表達(dá)量下調(diào),與芯片結(jié)果吻合?；虮倔w分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要參與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、免疫反應(yīng)以及細(xì)胞粘附等生物學(xué)過程。其中CDKN1C,CDKN2A,CTNNA3,COL6A3,HOXB4等差異表達(dá)基因與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、以及細(xì)胞粘附

8、等生物學(xué)過程密切相關(guān),而IL32,CXCL9,CXCL10參與免疫反應(yīng)過程。細(xì)胞成分方面,差異基因與細(xì)胞外基質(zhì)成分有關(guān)。分子功能方面,差異基因除了與蛋白結(jié)合,還與雙鏈DNA結(jié)合、核苷酸結(jié)合、生長(zhǎng)因子活化等相關(guān),而 HOX家族基因的差異表達(dá)與雙鏈DNA結(jié)合關(guān)聯(lián)密切。對(duì)芯片雜交結(jié)果差異表達(dá)的基因(差異倍數(shù)大于2,P<0.05)進(jìn)行Pathway分析,共分析出117個(gè)通路。篩選出P值小于0.05的通路,其中CDC14A,ITGB6,EGF,C

9、DKN2A等差異基因主要與黏著斑、轉(zhuǎn)化因子(TGF)信號(hào)通路、細(xì)胞周期信號(hào)通路、P53信號(hào)通路、腫瘤相關(guān)信號(hào)通路等相關(guān)。
　　結(jié)論:(1)miR-21基因與PDCD4蛋白在增生性瘢痕中的異常表達(dá)可能與增生性瘢痕的形成有關(guān)。
　　(2)人增生性瘢痕與正常皮膚組織比較,lncRNA表達(dá)譜發(fā)生了明顯變化,可能與增生性瘢痕的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　(3)人增生性瘢痕與正常皮膚組織比較,mRNA表達(dá)譜發(fā)生了明顯變化,TGFB1,