Hsa-miR-328及其靶基因PLCE1在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制探討.pdf

1、食管癌是中國常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在中國排在惡性腫瘤的第五位。其特點是預后差，死亡率高，死亡率居中國惡性腫瘤的第四位。
　　食管癌的病理類型主要為腺癌和鱗狀細胞癌(esophageal squamous cellcarcinoma，ESCC)。在我國，ESCC占食管癌的90％。盡管多項研究對于ESCC的發(fā)病機制進行了廣泛的探討，但是其發(fā)生發(fā)展機制目前仍不清楚。食管癌患者就診時多處于中晚期，相當部分的病人已不能手術(shù)治療，總的五年

2、生存率非常低。因此，深入研究ESCC的發(fā)生發(fā)展機制，對于提高ESCC的診斷和預后具有重要的意義。
　　微小RNA(miRNA)含有21～25個核苷酸，是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。miRNA的作用機制主要是與靶mRNA的3'非編碼區(qū)(3'-untranslated region，3'-UTR)或5'非編碼區(qū)(5'-untranslated region，5'-UTR)結(jié)合，最終負性調(diào)控靶基

3、因的表達。
　　Hsa-miR-328來源于人染色體16q22.1，可調(diào)節(jié)多種腫瘤細胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移，與多種腫瘤如非小細胞肺癌、胃癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系。但是，hsa-miR-328在ESCC中的表達及其對ESCC發(fā)生發(fā)展的影響未見報道。
　　研究目的:
　　探討hsa-miR-328及其靶基因磷脂酶Cε1(Phospholipase C epsilon1，PLCE1)在食管癌

4、發(fā)生發(fā)展中的作用及其相關機制。
　　研究方法:
　　1、實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，QRT-PCR)技術(shù)檢測并比較了hsa-miR-328在82例ESCC患者癌組織與配對的癌旁組織中的表達，分析了hsa-miR-328的表達與ESCC患者預后的關系，統(tǒng)計了hsa-miR-328與ESCC患者的性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和TNM分期之間的關系。<

5、br>　　2、QRT-PCR技術(shù)檢測了hsa-miR-328在不同食管上皮細胞系中的表達，增殖實驗、流式細胞術(shù)和transwell分別檢測了hsa-miR-328對人食管鱗癌細胞EC109和EC9706增殖、凋亡、遷移和侵襲功能的影響。QRT-PCR技術(shù)檢測了hsa-miR-328對EC109和EC9706細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標記物表達的影響。小管形成實驗檢測了hsa-miR-328在EC109和EC9706細胞的表達對人臍靜脈內(nèi)皮細胞HU

6、VEC小管形成的影響，增殖實驗和transwell分別檢測了hsa-miR-328在EC109和EC9706細胞的表達對HUVEC細胞增殖和遷移功能的影響。
　　3、采用生物信息學方法、免疫印跡和QRT-PCR預測并鑒定了hsa-miR-328的靶點。采用細胞增殖實驗、流式細胞術(shù)和transwell觀察了PLCE1對EC109和EC9706細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲功能的影響。
　　4、采用QRT-PCR和免疫組織化學檢測并

7、比較了PLCE1在82例ESCC患者癌組織與配對的癌旁組織中的表達，分析了PLCE1的表達與ESCC患者預后的關系，統(tǒng)計了PLCE1與ESCC患者的性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和TNM分期之間的相關性，分析了癌組織與癌旁組織中hsa-miR-328與PLCE1表達的相關性。
　　研究結(jié)果:
　　1、與配對的癌旁組織比較，hsa-miR-328在食管癌組織中的表達顯著降低(P＜0.05);64

8、.6％的患者中，hsa-miR-328在癌組織中的表達低于配對的癌旁組織，35.4％的患者中，hsa-miR-328在癌組織中的表達高于配對的癌旁組織;Hsa-miR-328表達上調(diào)患者（hsa-miR-328在癌組織中的表達高于配對的癌旁組織）的生存期顯著高于hsa-miR-328表達下調(diào)患者（hsa-miR-328在癌組織中的表達低于配對的癌旁組織）(P＜0.05);Hsa-miR-328的表達與性別、年齡和腫瘤位置無相關性，與腫瘤

9、大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和TNM分期呈負相關(P＜0.05)。
　　2、同人正常食管上皮細胞HEEC比較，EC109和EC9706中hsa-miR-328的表達顯著降低(P＜0.05);慢病毒轉(zhuǎn)染LV-miR-328顯著增加ESCC細胞內(nèi)hsa-miR-328的表達(P＜0.05)，慢病毒轉(zhuǎn)染LV-anti-miR-328顯著降低ESCC細胞內(nèi)hsa-miR-328的表達(P＜0.05);同LV-NC組比較，LV-mi

10、R-328組細胞的增殖、遷移和侵襲功能顯著降低(P＜0.05)，LV-anti-miR-328組細胞的增殖、遷移和侵襲功能顯著增加(P＜0.05);凋亡檢測表明，同LV-NC組比較，LV-miR-328組的細胞凋亡比例顯著增加(P＜0.05)，LV-anti-miR-328組的細胞凋亡比例顯著降低(P＜0.05);同LV-NC組比較，LV-miR-328組和LV-anti-miR-328組細胞的E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達

11、均無顯著改變(P＞0.05);同LV-NC組比較，LV-miR-328組和LV-anti-miR-328組的HUVEC細胞的小管形成能力、增殖能力和遷移能力無顯著改變(P＞0.05)。
　　3、生物信息學方法預測PLCE1是hsa-miR-328的潛在靶點;雙熒光素酶檢測、免疫印跡和QRT-PCR結(jié)果表明，PLCE1是hsa-miR-328的靶點;成功構(gòu)建了pCDNA3/PLCE1高表達載體;同對照組比較，pCDNA3/PLCE1

12、組細胞的增殖、遷移和侵襲功能顯著增加(P＜0.05)，細胞凋亡比例顯著降低(P＜0.05);同LV-miR-328組比較，LV-miR-328+pCDNA3/PLCE1組細胞的增殖、遷移和侵襲功能顯著增加(P＜0.05)，細胞凋亡比例顯著降低(P＜0.05)。
　　4、與配對的癌旁組織比較，PLCE1在食管癌組織中的表達顯著增加(P＜0.05);62.2％的患者中，PLCE1在癌組織中的表達高于配對的癌旁組織，37.8％的患者中，

13、PLCE1在癌組織中的表達低于配對的癌旁組織;PLCE1表達上調(diào)患者（PLCE1在癌組織中的表達高于配對的癌旁組織）的生存期顯著低于PLCE1表達下調(diào)患者（PLCE1在癌組織中的表達低于配對的癌旁組織）(P＜0.05);PLCE1的表達與同性別、年齡、腫瘤位置和分化程度無相關性，與腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期呈正相關(P＜0.05);在ESCC患者的癌組織與癌旁組織中，hsa-miR-328與PLCE1的表達呈負相關(P＜