miR-135b在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機制的初步探討.pdf

1、子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中占20-30％，在發(fā)達(dá)國家的女性惡性腫瘤中位居第四位。
　　miRNA是近些年來研究的熱點，是一類廣泛存在的非編碼單鏈小分子RNA，是Lee等最早在秀麗線蟲中發(fā)現(xiàn)的，長度約為19-25個核苷酸。miR-135b基因位于第1號染色體長臂第3區(qū)2號帶的第1號亞帶(1q32.1)，其存骨肉瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌等多種腫瘤中表達(dá)上升。在非小細(xì)胞肺癌中，miR-

2、135b通過激活Hippo信號通路和靶向LZTS1促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。Arigoni等發(fā)現(xiàn)miR-135b表達(dá)上調(diào)并通過靶向雌激素受體α、雄激素受體和缺氧誘導(dǎo)因子1α促進(jìn)乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞的增殖。
　　目的:
　　本課題通過探討miR-135b在子宮內(nèi)膜癌組織及4株細(xì)胞中表達(dá)情況，運用體外細(xì)胞實驗證明miR-135b的生物學(xué)特性，并進(jìn)一步探討了miR-135b在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用和分子機制，為進(jìn)一步尋找新的子宮內(nèi)膜癌發(fā)病

3、機制和治療的靶點奠定了理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.RT-PCR檢測miR-135b在子宮內(nèi)膜癌組織與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)
　　從子宮內(nèi)膜癌組織和細(xì)胞中抽提總RNA，按寶生物公司逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒說明書，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，根據(jù)SYBR Green法進(jìn)行熒光定量PCR，以2-△△Ct表示基因的相對表達(dá)水平。
　　2.RT-PCR檢測瞬時轉(zhuǎn)染miRNA135b的轉(zhuǎn)染效率
　　采用陽離子脂質(zhì)體法，

4、按照LipofectamineTM3000試劑說明書進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1天將處于對數(shù)生長期的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株RL-952和Ishikawa消化、離心、計數(shù)，約為2×105/孔接種至6孔板中并繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度為30-50％時進(jìn)行實驗。棄上清，加入1.7ml含10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基;將購自于RiboBio公司的100nMsiRNA加入到無血清培養(yǎng)基中配制混合液①150μl，吹打混勻;將5μlLipofectamineTM

5、3000脂質(zhì)體加入到另一無血清培養(yǎng)基中配制混合液②150μl，吹打混勻，室溫孵育5min;將混合液②分別加入混合液①中，室溫孵育20min，以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，并最終加入到1.7ml含10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，輕搖混勻。其中，mimic NC和inhibitor NC作為內(nèi)參。48h后抽提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT-PCR檢測瞬時轉(zhuǎn)染后miR-135b的表達(dá)變化。
　　3.噻唑藍(lán)(MTT)比色實驗檢測細(xì)胞增殖

6、能力
　　將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔板中，12h細(xì)胞貼壁后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分為mimic、 mimic NC、 inhibitor、 inhibitor NC和空白組，6孔/組，分別于轉(zhuǎn)染后0h、24h、48h、72h、96h檢測一次。檢測前每孔中加入5mg/ml的MTT溶液20μl，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，加入DMSO溶液150μl，搖床上室溫輕搖10min充分溶解結(jié)晶物，以空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀上測定490n

7、m波長處的吸光度值，用來表示細(xì)胞增殖能力。各組取6孔平均值，繪制生長曲線。
　　4.細(xì)胞劃痕試驗檢測細(xì)胞遷移能力
　　將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞RL-952接種在六孔板中，瞬時轉(zhuǎn)染48h細(xì)胞融合度為90％時，用200μl加樣槍頭，沿直尺垂直培養(yǎng)孔并經(jīng)過其中點制造“十”字樣劃痕。棄上清，PBS緩沖液洗2-3次，以去除脫落細(xì)胞，更換為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。選取有劃痕穿過的視野于0，24h，48h進(jìn)行拍照，計算并比較各組的遷移率。
　

8、　5.RT-PCR檢測FOXO1和HOXA10在子宮內(nèi)膜癌組織與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)
　　6.RT-PCR檢測瞬時轉(zhuǎn)染miRNA135b后FOXO1的mRNA的變化
　　子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株RL-952和Ishikawa轉(zhuǎn)染48h后提取細(xì)胞總RNA，按寶生物公司逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒操作，采用△△CT法對熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行定量分析，根據(jù)各樣本的Ct值，以2-△△Ct表示基因的相對表達(dá)水平。
　　7.Western

9、 blot檢測在FOXO1子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞內(nèi)變化
　　RL-952細(xì)胞株轉(zhuǎn)染48h后，提取全蛋白，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，測定A562。計算各濃度蛋白標(biāo)準(zhǔn)的平均吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。提取的總蛋白，加入2×SDS蛋白上樣緩沖液（按1∶1比例），100℃煮沸5min.-20℃保存?zhèn)溆?。Western blot檢測各組FOXO1蛋白的表達(dá)。
　　8.統(tǒng)計學(xué)處理
　　采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計

10、學(xué)分析。數(shù)值大小以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示。22例子宮內(nèi)膜癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中表達(dá)的比較采用兩配對樣本t檢驗，其余實驗組間比較采用ANOVA單因素方差分析，MTT生長曲線比較采用析因設(shè)計的方差分析。所有數(shù)據(jù)均為3次獨立重復(fù)實驗的結(jié)果，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.RT-PCR檢測miR-135b在子宮內(nèi)膜癌組織內(nèi)表達(dá)
　　應(yīng)用RT-PCR檢測22對配對的子宮內(nèi)膜癌組織中miR-135b的表達(dá)，以

11、1NC為參考值，2-△△Ct通過配對樣本t檢驗分析，結(jié)果示子宮內(nèi)膜癌組織中miR-135b的平均表達(dá)量為8.3559±10.6692，顯著大于子宮內(nèi)膜癌癌旁組織中miR-135b的平均表達(dá)量為4.1930±5.1132，具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.247，P=0.036)。
　　2.RT-PCR檢測miR-135b、FOXO1在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)
　　以JEC細(xì)胞為參照（圖1），miR-135b在不同細(xì)胞中的表達(dá)量分別為Is

12、hikawa(111.5150±11.7878)、HEC-1-B(20.8096±5.7010)、RL-952(1.6737±0.3428)4株細(xì)胞之間miR-135b的表達(dá)水平有差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=129.3，P＜0.0001)。FOXO1在不同細(xì)胞中的表達(dá)量分別為Ishikawa（0.0640±0.0150）、HEC-1-B（0.2994±0.0592）、RL-952（0.4548±0.1053）4株細(xì)胞之間FOXO1的表達(dá)

13、水平有差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=85.36，P＜0.0001)。
　　3.qRT-PCR檢測子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株瞬時轉(zhuǎn)染miRNAs后miR-135b的表達(dá)
　　采用脂質(zhì)體法將miR-135bmimics和inhibitor及其對照mimics NC和inhibitorNC轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株RL-952和Ishikawa。轉(zhuǎn)染48h后，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后qRT-PCR檢測miR-135b的表達(dá)。結(jié)果顯示，miR-135b

14、mimics使RL-952、Ishikawa中miR-135b的表達(dá)分別提高了526.39倍（t=-20.189，P=0.002）和32.98倍(t=52.609，P=0.000);而轉(zhuǎn)染miR-135b inhibitor后，miR-135b的表達(dá)分別降低25.28％(t=-23.539,P=0.002)和95％(t=5.966,P=0.027)。
　　4.qRT-PCR檢測子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁組織中FOXO1的mRNA的水平<

15、br>　　應(yīng)用RT-PCR檢測22對配對的子宮內(nèi)膜癌組織中FOXO1的表達(dá)，以1NC為參考值，2-△△Ct通過配對樣本t檢驗分析，結(jié)果示子宮內(nèi)膜癌組織中FOXO1的平均表達(dá)量為1.6654±1.6861，顯著大于子宮內(nèi)膜癌癌旁組織中FOXO1的平均表達(dá)量為3.2708±3.4159，具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.559，P=0.018)。
　　5.MTT比色實驗
　　我們采用MTT法檢測細(xì)胞生長曲線，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-135

16、b mimic后，RL-952和Ishikawa細(xì)胞生長加快(P=0.0000，0.0000);而轉(zhuǎn)染miR-135b inhibitor后，兩種細(xì)胞生長速度減慢(P=0.0000，0.0000)。
　　6.劃痕試驗
　　人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株RL-952轉(zhuǎn)染48h后，細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力的變化，遷移率=（原始間距-遷移后間距）/原始間距×100。劃痕24h后，四個組之間遷移率經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，具有顯著性差異（F=24.67

17、，P=0.0002），劃痕48h后，四個組之間遷移率經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，具有顯著性差異（F=36.36，P＜0.0001）。
　　7.qRT-PCR檢測子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁組織中FOXO1和HOXA10的mRNA的水平
　　8.qRT-PCR檢測瞬時轉(zhuǎn)染miRNA135b后FOXO1的mRNA的水平
　　9.Western blot檢測在FOXO1子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞內(nèi)變化
　　結(jié)論:
　　1.miR-135b在子宮內(nèi)

18、膜癌組織中表達(dá)顯著高于其對應(yīng)的癌旁組織。
　　2.miR-135b參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病及增殖和遷移作用，其表達(dá)失調(diào)可影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的體外增殖和遷移能力，扮演著癌基因的角色。
　　3.FOXO1在子宮內(nèi)膜癌組織中較其對應(yīng)的癌旁組織降低。
　　4.HOXA10在子宮內(nèi)膜癌組織中較其對應(yīng)的癌旁組織降低。
　　5.在子宮內(nèi)膜癌中，F(xiàn)OXO1為miR-135b的靶基因，miR-135b通過靶向FOXO1抑制其轉(zhuǎn)錄從而