mir-503靶基因PRKACA的鑒定及其在食管鱗癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能.pdf

1、目的:檢測(cè)應(yīng)激條件下miR-503的表達(dá);鑒定miR-503的靶基因PRKACA;研究PRKACA基因編碼的蛋白對(duì)食管鱗癌細(xì)胞Eca9706和Eca109功能的影響及其生物學(xué)機(jī)制。
　　方法:1、分別在缺糖、缺氧及饑餓條件下培養(yǎng)Eca109和Eca9706細(xì)胞，采用Taqman探針?lè)z測(cè)miR-503的表達(dá)情況。
　　2、體外設(shè)計(jì)并合成3組干擾PRKACA mRNA表達(dá)的siRNA,采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞株Eca109

2、和Eca9706。
　　3、 Western Blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染PRKACA-siRNA后Eca109的PRKACA蛋白的表達(dá)水平，評(píng)估干擾效果。
　　4、通過(guò)CCK-8試劑盒檢測(cè)干擾PRKACA基因表達(dá)后Eca109和Eca9706細(xì)胞增殖能力的改變。
　　5、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)PRKACA對(duì)Eca109和Eca9706細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　6、利用流式細(xì)胞術(shù)分析PRKACA基因?qū)c

3、a109和Eca9706細(xì)胞周期的影響。
　　7、將miR-503mimics及miR-503 negative control分別轉(zhuǎn)染Eca109，之后采用偶聯(lián)AGO2抗體的beads來(lái)免疫沉淀miRNA-mRNA-AGO2蛋白復(fù)合體，而在另一組實(shí)驗(yàn)中采用IgG替換AGO2抗體，然后都用TRizol法來(lái)抽提沉淀的總RNA，最后實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)PRKACA mRNA的表達(dá)。
　　8、擴(kuò)增PRKACA3'-UTR的種子區(qū)及

4、突變種子區(qū)，且在兩端加上SpeⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)后構(gòu)建至雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pMIR-PRKACA和pMIR-PRKACA-mutant;將miR-503 mimics、miR-503 negative control、pMIR-PRKACA和pMIR-PRKACA-mutant，分別共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞;裂解細(xì)胞后加入底物，檢測(cè)熒光素酶活性。
　　9、通過(guò)生物信息學(xué)方法即GO基因分類法、KEGG Pathways法預(yù)測(cè)miR

5、-503在食管鱗癌中靶基因。
　　10、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包，兩指標(biāo)間的比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩項(xiàng)以上的采用單因素方差分析;計(jì)量資料采用t檢驗(yàn);差異性分析用配對(duì)x2檢驗(yàn);相關(guān)性檢驗(yàn)用Spearman相關(guān)分析，以α=0.05為標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果:1、Taqman探針?lè)ńY(jié)果表明，在缺糖、缺氧及饑餓條件下，Eca109和Eca9706中的miR-503的表達(dá)水平顯著升高;
　　2、siRN

6、A轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞，分別命名為PRKACA-siRNA-Eca109-1、PRKACA-siRNA-Eca109-2、PRKACA-siRNA-Eca109-3和siRNA-NC組，經(jīng)過(guò)48h的培養(yǎng)，使用Western Blot篩選對(duì)PRKACA基因表達(dá)干擾效果最好的siRNA。
　　3、轉(zhuǎn)染siRNA-PRKACA后48h，與對(duì)照組比較的結(jié)果顯示，PRKACA-siRNA-Eca109-3組的PRKACA蛋白的表達(dá)水平明顯降

7、低(P＜0.05)，顯示干擾siRNA序列能夠顯著下調(diào)PRKACA的表達(dá)，同時(shí)Vimentin表達(dá)相對(duì)下調(diào)，E-cadherin表達(dá)升高，CyclinD1和CyclinE1蛋白的表達(dá)水平降低。
　　4、CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PRKACA基因抑制組食管鱗癌細(xì)胞增殖速度減慢(P＜0.05)，對(duì)照組細(xì)胞的增殖速度加快(P＜0.05)。表明PRKACA能夠促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖;
　　5、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾組食管鱗癌細(xì)

8、胞。遷移實(shí)驗(yàn)，Eca109的mimics組鏡下細(xì)胞數(shù)是55個(gè)，Eca9706(x100)的mimics組為82個(gè);侵襲實(shí)驗(yàn)，Eca109及Eca9706的mimics組分別為47、51個(gè);兩個(gè)細(xì)胞株的兩組實(shí)驗(yàn)相較對(duì)照組都有顯著性差異(P＜0.05)。說(shuō)明PRKACA基因的表達(dá)能夠促進(jìn)Eca109及Eca9706細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　6、流式細(xì)胞檢測(cè)siRNA-PRKACA陽(yáng)性的Eca細(xì)胞。Eca109組G0/G1細(xì)胞比例61.47

9、％，S期比例20.95％，G2/M期17.58％;Eca9706組G0/G1細(xì)胞比例68.18％，S期比例17.61％，G2/M期14.21％;兩組細(xì)胞與對(duì)照組比較均有顯著性差異(P＜0.05)。表明PRKACA基因的抑制可以導(dǎo)致食管鱗癌細(xì)胞G1期的阻滯。
　　7、通過(guò)GO基因分類法、KEGG Pathways法發(fā)現(xiàn)與miR-503緊密相關(guān)的PRKCG、PRKACA、RICTOR、SMAD7、WNT4及WNT3A，都可能是miR-

10、503的靶基因。
　　8、RIP實(shí)驗(yàn)顯示，miR-503 mimics組PRKACA mRNA的表達(dá)水平顯著高于miR-503 negative control組(P＜0.05)，推測(cè)PRKACA是miR-503的靶基因。
　　9、實(shí)驗(yàn)組中熒光素酶活性相比對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)，顯示miR-503 mimics對(duì)pMIR-PRKACA的熒光素酶表達(dá)有抑制作用，提示PRKACA是miR-503的靶基因;miR-503

11、mimics和pMIR-PRKACA-mutant共轉(zhuǎn)染組熒光強(qiáng)度顯著降低，而對(duì)照組無(wú)顯著改變，說(shuō)明miR-503 mimics對(duì)pMIR-PRKACA-mutant表達(dá)有抑制作用，表明PRKACA是miR-503的靶基因。
　　結(jié)論:1.說(shuō)明缺氧、缺糖及饑餓是誘發(fā)食管鱗癌細(xì)胞miR-503表達(dá)升高的重要因素。
　　2.SiRNA干擾PRKACA蛋白，提示PRKACA具有促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移的作用。