果蠅miR-184靶基因的篩選及功能的初步研究.pdf

1、miRNA（microRNA）是一類長(zhǎng)度為21～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼蛋白的小RNA，其作用遍及生命體的發(fā)生、生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和死亡等過程。它可通過部分堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與目的mRNA靶位的3’非翻譯區(qū)（3’UTRs）結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA降解或轉(zhuǎn)錄后抑制，從而有效的沉默靶mRNA。miR-184是一種廣泛存在于果蠅、小鼠、人等多種生物中的miRNA，在不同物種中具有高度的保守性。本文中我們利用果蠅這一優(yōu)良的動(dòng)物模型進(jìn)行研究，希望能以

2、此揭示或提示miR-184的功能。
　　 首先我們利用RT-PCR方法對(duì)pri-miR-184在不同時(shí)期和組織的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)：同時(shí)利用液相雜交、核糖核酸酶保護(hù)法對(duì)成熟miR-184進(jìn)行了直接的檢測(cè)；另外還制備針對(duì)pri-miR-184的地高辛探針，對(duì)果蠅胚胎進(jìn)行了原位雜交檢測(cè)。結(jié)果顯示：果蠅體內(nèi) miR-184的表達(dá)伴隨著果蠅的發(fā)育呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì)，在胚胎發(fā)育的中后期、三齡幼蟲時(shí)，miR-184的表達(dá)量達(dá)到了高峰，在不同組

3、織的檢測(cè)表明miR-184在眼disc和腦disc高表達(dá)；原位雜交結(jié)果顯示miR-184在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)高表達(dá)。這些結(jié)果提示了miR-184表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)間特異性和組織特異性，并且可能參與了神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控或正常的神經(jīng)生理功能。
　　 其次我們構(gòu)建了含mir-184上下游的pW25重組質(zhì)粒，通過顯微注射得到P因子轉(zhuǎn)基因果蠅，再利用 BL6935利BL6938兩株工具果蠅進(jìn)行雜交，發(fā)生同源重組，得到21株紅眼果蠅，經(jīng)鑒定其中5株為mi

4、R-184缺失的轉(zhuǎn)基因果蠅。
　　 由于本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)中胚層特異性工具果蠅（24B-Gal4）驅(qū)動(dòng)miR-184過表達(dá)時(shí)出現(xiàn)幼蟲發(fā)育遲緩，蛹前期致死，與蛻皮激素及通路異常產(chǎn)生的表型有一定的相似之處，我們推測(cè)miR-184可能和蛻皮激素的途徑有關(guān)。由于蛻皮激素喂食實(shí)驗(yàn)不能挽救表型缺陷，因此我們推測(cè)該表型與蛻皮激素的多少?zèng)]有關(guān)系，而與蛻皮激素信號(hào)通路有關(guān)。在本課題中，我們利用miR-184突變體果蠅和前期本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的miR-