miR-107在核纖層蛋白基因缺失小鼠中的表達(dá)及功能的初步研究.pdf

1、人類(lèi)LMNA基因突變可引起嚴(yán)重的早發(fā)性衰老、肌肉營(yíng)養(yǎng)不良、家族部分性脂肪營(yíng)養(yǎng)不良和心肌病綜合癥等多種疾病，這些疾病統(tǒng)稱(chēng)為核纖層蛋白病。Lmna基因缺失小鼠具有核纖層蛋白病類(lèi)似的臨床特征，是研究核纖層蛋白功能及其相關(guān)疾病的一種常用動(dòng)物模型。MicroRNA（miRNA）是一類(lèi)強(qiáng)大的基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)參與細(xì)胞內(nèi)多種生理、病理過(guò)程，包括衰老和心肌病等。盡管如此，miRNA在核纖層蛋白病中的表達(dá)、功能尚不完全清楚。本文擬利

2、用Lm na基因缺失小鼠模型篩選差異表達(dá)的miR N A，并進(jìn)一步探討其在核纖層蛋白病中的作用及其潛在分子機(jī)制。
　　第一部分miR-107在Lmna-/-小鼠MEFs及各組織中的表達(dá)
　　目的:驗(yàn)證前期通過(guò)Illumina Next Gen Sequencing方法篩選的在Lmna缺失和野生型C57BL/6小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）中差異表達(dá)的miRNA并探討其功能。
　　方法:應(yīng)用real time PCR技術(shù)

3、驗(yàn)證在測(cè)序結(jié)果中差異表達(dá)的miR NA（如mmu-m iR-1、m iR-107、m iR-671-5p等）；選取差異較大的miR-107，檢測(cè)其在Lm na-/-和L mna+/+C57BL/6小鼠不同組織中的表達(dá)。
　　結(jié)果: miR-107在L mn a-/-小鼠MEFs中的表達(dá)水平顯著低于Lm na+/+MEF s，下調(diào)約52.1％（P＜0.05）；同時(shí)，Lm na-/-小鼠肝臟、心臟和肺組織中miR-107的表達(dá)均低于L

4、mna+/+小鼠（P＜0.05）。
　　結(jié)論:與野生型C57BL/6小鼠相比，miR-107在Lmna-/-小鼠MEF s及心、肝、肺組織中呈顯著低水平表達(dá)。
　　第二部分miR-107及其靶基因CAV1參與調(diào)控Lmna-/-MEFs的衰老
　　目的:探討miR-107與已知靶基因C AV1在Lm na缺失和野生型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞衰老中的作用。
　　方法:分別在L mna-/-和L mna+/+MEF s中過(guò)表

5、達(dá)或沉默miR-107的表達(dá)，檢測(cè)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶的活性及靶基因C AV1的表達(dá)變化。
　　結(jié)果: Lm na-/-MEFs中Ca v1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增高，約為L(zhǎng)mna+/+MEFs中Cav1 mRNA表達(dá)的1.7倍（P＜0.05）。Lmna-/-MEFs（P4）中轉(zhuǎn)染miR-107的模擬物mimics，可顯著抑制CAV1的表達(dá)，β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率減少約8%（P＜0.05）；而在Lmna+/+M

6、EFs（P4）中下調(diào)miR-107，可上調(diào) CAV1的表達(dá)，β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率增加約為10%（P＜0.05）。
　　結(jié)論: Lmna-/-MEFs中Cav1的表達(dá)水平顯著高于Lmna+/+MEFs，miR-107可能通過(guò)調(diào)節(jié)CAV1的表達(dá)水平，參與調(diào)控MEF s的衰老。
　　第三部分miR-107靶基因Cacna2d1的驗(yàn)證及結(jié)合位點(diǎn)研究
　　目的:生物信息學(xué)預(yù)測(cè)并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mmu-m iR-107的靶基因

7、Cacna2d1。
　　方法:利用TargetScan、miRanda、Clip-seq及miRDB預(yù)測(cè)其靶基因，分別構(gòu)建含有候選靶基因（Cacna2d1、Capza2、Celsr2、Csnk1g2和Tmem47）3'UTR的熒光素酶報(bào)告載體pGL3，并用重疊延伸P CR技術(shù)分別構(gòu)建含有Ca cna2 d1基因結(jié)合miR-107位點(diǎn)的3' UTR單個(gè)突變位點(diǎn)的載體Mut1200-207、Mut2361-367、Mut3902-90

8、8和同時(shí)含有3個(gè)突變結(jié)合位點(diǎn)的載體Mut4plus。將各重組質(zhì)粒與miRNA mimics共轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性。實(shí)時(shí)定量PCR和免疫印跡法進(jìn)一步驗(yàn)證miR-107對(duì)靶基因Cacna2d1的調(diào)控作用。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建分別含有5個(gè)候選靶基因3' UTR的熒光素酶報(bào)告載體和C a cn a2d1的4個(gè)突變質(zhì)粒；與共轉(zhuǎn)染候選基因3' UTR質(zhì)粒和miR-NC組相比，共轉(zhuǎn)染pGL3-Cacna2d13'UTR及miR-

9、107 mimics組C2C12細(xì)胞熒光素酶活性下降33.4%（P<0.01）；且與共轉(zhuǎn)染對(duì)應(yīng)的突變體和miR-NC組相比，轉(zhuǎn)染突變體Mut2361-367/Mut3902-908和miR-107 mimics組的熒光素酶活性均下降（P<0.05）；轉(zhuǎn)染突變體Mut1200-207/Mut4plus和miR-107 mimics組的熒光素酶活性下降不明顯（P>0.05）。其余候選靶基因Capza2、Celsr2、Csnk1g2和Tmem