miR-17-92基因簇在骨肉瘤中表達(dá)和功能的初步研究.pdf

1、目的：
　　微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性的非編碼多功能小分子RNA。其作用機(jī)制是通過(guò)與下游目的靶基因mRNA分子的3′端非編碼區(qū)結(jié)合并抑制該mRNA分子的翻譯。本實(shí)驗(yàn)研究miR-17-92基因簇及成員miRN As在骨肉瘤組織和骨肉瘤細(xì)胞株中的表達(dá)及miRNA-19b（miR-19b）在骨肉瘤細(xì)胞中的功能，并且探索其可能的分子機(jī)制。
　　方法：
　　運(yùn)用普通PCR和實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)21例

2、骨肉瘤組織和同一患者的鄰近正常骨組織中miR-17-92基因簇的表達(dá)，并根據(jù)臨床資料評(píng)估m(xù)iR-17-92基因簇的臨床意義。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)分析MG-63、U-2 OS和SaOS-2骨肉瘤細(xì)胞和人成骨細(xì)胞hFOB1.19中miR-17-92基因簇6個(gè)成員miRNA的表達(dá)情況，篩選單個(gè)miRNA和骨肉瘤細(xì)胞株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)；構(gòu)建miR-19b Inhibitor質(zhì)粒，使用miR-19b Inhibitor和陰性對(duì)照（質(zhì)粒NC）轉(zhuǎn)染骨

3、肉瘤MG-63細(xì)胞；利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)MG-63細(xì)胞中miR-19b的表達(dá)變化，運(yùn)用MTS方法觀察轉(zhuǎn)染前后MG-63細(xì)胞增殖能力的變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后MG-63細(xì)胞周期情況；Tunel法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后MG-63細(xì)胞凋亡情況；Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染前后MG-63細(xì)胞侵襲能力的改變。運(yùn)用TargetSca n、M iRa nda、MiRD、RNA22和 Mirwalk等生物信息學(xué)方法對(duì) miR-19b靶

4、基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)了轉(zhuǎn)染前后MG-63細(xì)胞中MFN1的表達(dá)；雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)鑒定miR-19b與靶基因MFN1之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1. miR-17-92基因簇在所有的骨肉瘤組織中都有表達(dá)，且在腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于在正常骨組織中的表達(dá)，同時(shí)miR-17-92基因簇的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤部位、分化程度無(wú)關(guān)，而與腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移相關(guān)；
　　2．六個(gè)成員mi

5、RNAs中，miR-19b在MG-63、U-2 OS和SaOS-2骨肉瘤細(xì)胞株中明顯高表達(dá)；miR-19b在骨肉瘤 MG-63細(xì)胞中表達(dá)最高，因而選擇 miR-19b和MG-63細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；
　　3．外源性降低miR-19b的表達(dá)能顯著抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞的增殖、侵襲能力，使細(xì)胞周期停滯在G1期，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡；
　　4．miR-19b直接負(fù)性調(diào)控抑癌基因MFN1的表達(dá)。使用生物信息學(xué)方法分析，預(yù)測(cè)出MFN1是m

6、iR-19b的靶基因。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)MFN1是miR-19b的下游靶點(diǎn)；實(shí)時(shí)定量PCR和WesternBlots進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)染miR-19b inhibitor后，靶蛋白表達(dá)出現(xiàn)明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1. miR-17-92基因簇在骨肉瘤組織和骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)， miR-17-92基因簇高表達(dá)和骨肉瘤患者遠(yuǎn)期發(fā)生轉(zhuǎn)移相關(guān)，與年齡、性別、腫瘤部位、分化程度等無(wú)關(guān)，提示miR-17-92基因簇高表達(dá)潛在的導(dǎo)致腫瘤

7、轉(zhuǎn)移，其可以作為骨肉瘤患者預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。
　　2．miR-19b在骨肉瘤發(fā)病是致癌性miRNA。抑制miR-19b表達(dá)，可以明顯抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖和侵襲能力，促進(jìn)凋亡；提示miR-19b表達(dá)水平可能參與細(xì)胞功能的分子調(diào)控，有可能成為骨肉瘤治療的分子靶點(diǎn)。
　　3．在MG-63細(xì)胞中miR-19b和抑癌基因MFN1的蛋白和mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。miR-19b在骨肉瘤中的顯著上調(diào)可能通過(guò)負(fù)調(diào)控下游靶基因MFN