毛竹miR164b及其靶基因PeNAC1的克隆與功能研究.pdf

1、非生物逆境脅迫是影響植物生長發(fā)育以及生物產(chǎn)量的主要因素之一，為適應環(huán)境植物形成了一套內(nèi)在的自身調(diào)節(jié)機制，其中miRNA主要通過剪切降解靶基因或者抑制其翻譯達到調(diào)控的目的。miR164家族是植物特有的，其中miR164b主要的靶標基因是編碼NAC的轉錄因子，NAC參與調(diào)控植物生長發(fā)育過程以及對高鹽、干旱等非生物逆境脅迫響應過程。因此，研究miR164及其靶基因NAC的功能對于揭示二者之間的調(diào)控方式及其在抗逆過程中的作用具有重要意義。本文以

2、毛竹（Phyllostachys edulis）為研究對象，分離了毛竹ped-miR164b相關序列和靶基因PeNAC1序列，在分析基因結構特點的基礎上，通過RLM-5'RACE技術驗證ped-miR164b對PeNAC1的作用位點，分析二者的表達模式，通過轉基因技術驗證其功能，為今后竹子抗逆分子育種提供參考依據(jù)，主要結果如下:
　　(1)基因序列的獲得及生物信息學分析
　　從毛竹數(shù)據(jù)庫（BambooGDB，www.bamb

3、oogdb.org）中獲得miR164家族兩個成員，分別為ped-miR164a和ped-miR164b。根據(jù)ped-miR164b前體序列(PH01000543)設計特異性引物進行擴增，得到前體序列82 bp，二級結構預測結果表明該序列可形成穩(wěn)定的莖環(huán)結構，且對應成熟序列（5'-UGGAGAAGCAGGGCACGUGCU-3'）位于5'端臂上。ped-miR164b成熟序列保守性較高，與其它植物miR164家族成熟序列標準序列僅相差于

4、最后一個堿基序列(A→U)。
　　以玉米（Zea mays）Zm NA C1為誘餌，在毛竹全長cDNA數(shù)據(jù)庫中搜索獲得同源基因序列(FP095491)，特異性擴增獲得其ORF序列，長度為867 bp，編碼一個288個氨基酸的蛋白。序列分析表明，在ORF的3'端包含與miR164b相匹配的靶點序列（5'-AGCAAGTGCCCTGCTTCTCCA-3'）; ORF編碼的蛋白與擬南芥（Arabidopsisthaliana）、水稻（O

5、ryza sativa）、玉米的NAC1具有較高的相似度（94％以上），包含NAC1特有的A、B、C、D和E五個蛋白結構域，因此將該基因命名為PeNAC1。
　　(2)切割位點驗證分析
　　采用RLM-5'RACE技術，驗證ped-miR164b對其靶基因PeNAC1的切割作用。結果表明:PCR產(chǎn)物進行回收測序發(fā)現(xiàn)10個樣品中有9個的剪切位點在靶點序列的第10-11位堿基之間，說明ped-miR164b可在轉錄水平對其靶基因

6、PeNAC1進行切割，調(diào)控其表達。這與在玉米中miR164對其靶基因ZmNA C1的切割位點相一致，進一步證明植物miR164切割位點的保守性。
　　(3)基因時空表達分析
　　采用實時定量PCR方法對ped-miR164b及PeNAC1進行組織特異性表達分析，結果表明，二者均在根、莖、葉和鞘中表達，為組成型表達，且ped-miR164b在根中表達量最高，而PeNAC1則在根中表達量最低。實時定量PCR結果表明，NaCl(3

7、00 mmol·L-1)、低溫(4℃)和強光(1500μmol·m-2·s-1)處理后毛竹葉片中ped-miR164b的表達均下調(diào)，GA3(100μmol·L-1)處理后ped-miR164b表達量則上調(diào)，而在同樣處理條件下，PeNAC1的表達恰好呈現(xiàn)出與其完全相反的趨勢。由此表明，ped-miR164b及其靶基因PeNAC1可能響應植物抗逆及激素信號轉導過程。
　　(4)基因異位表達及轉基因植株表型分析
　　分別構建ped

8、-miR164b前體的過量表達載體以及PeNAC1的正、反義植物表達載體，轉化模式植物擬南芥。結果表明，轉ped-miR164b的擬南芥植株子葉或者葉柄發(fā)生不同程度的融合，有的子葉則發(fā)育形成杯狀，有的蓮座葉發(fā)育不正常，如出現(xiàn)非對稱子葉、缺刻葉片、不規(guī)則葉片，有的根系生長明顯受到抑制，側根數(shù)量減少。轉正義PeNAC1的擬南芥植株，相對野生型植株，生長較快，側根數(shù)目相對較多;而轉反義PeNAC1的植株則生長相對較慢，個體矮小，有的株系則出現(xiàn)

9、與轉ped-miR164b植株相似的表型，即缺葉或者非對稱葉表型，同時側根數(shù)目也相對較少，有的株系根長度變短。
　　(5)轉基因植株抗逆性分析
　　分別對轉基因植株進行NaCl（300 mmol·L-1）和PEG6000(30％)處理，以野生型擬南芥為對照，統(tǒng)計成活率，同時進行葉綠素熒光參數(shù)測定。結果表明，轉正義PeNAC1基因的轉基因植株成活率達到80-90％，熒光參數(shù)Fv/Fm下降趨勢較緩慢;而過表達ped-miR164

10、b和轉反義PeNAC1基因的轉植株成活率為20-30％，熒光參數(shù)Fv/Fm下降趨勢較快。由此表明，ped-miR164b及靶基因PeNAC1可能通過影響轉基因植株根的發(fā)育進而影響其抗性。
　　(6)ped-miR164b前體上游啟動子序列分離及活性分析
　　經(jīng)過特異性擴增獲得ped-miR164b前體上游啟動子區(qū)域序列(1，480bp)，通過在線平臺Plant CARE（http://bioinformatics.psb.u

11、gent.be/Webtools/plantcare/html/）分析結果表明，此序列包含啟動子基本作用元件，如TATA-box、CAAT-box等，此外還包括許多和逆境相關的響應元件，如ARE、LTR和MBS等，這說明ped-miR164b可能參與調(diào)控植物逆境脅迫過程。構建該啟動子區(qū)域序列與GUS基因融合的表達載體，將其轉入模式植物擬南芥，通過篩選抗性植株，進行GUS組織化學染色。結果表明，轉基因植株的根、莖和葉中均呈現(xiàn)藍色，表明該啟

12、動子能夠調(diào)控GUS報告基因的表達，具有生物活性，且為組成型啟動子。
　　MiR164家族和NAC轉錄因子家族均是植物特有的，本研究結果表明ped-miR164b及PeNAC1都是組成型表達，參與激素和非生物脅迫條件的應答調(diào)節(jié)。在模式植物擬南芥中過量表達ped-miR164b及PeNAC1，均影響轉基因植株葉及根的形態(tài)建成。在干旱、鹽脅迫條件下，ped-miR164b和PeNAC1轉基因植株的生理指標測定結果證明ped-miR164