毛竹miR164b及其靶基因PeNAC1的克隆與功能研究.pdf

1、非生物逆境脅迫是影響植物生長發(fā)育以及生物產(chǎn)量的主要因素之一，為適應(yīng)環(huán)境植物形成了一套內(nèi)在的自身調(diào)節(jié)機(jī)制，其中miRNA主要通過剪切降解靶基因或者抑制其翻譯達(dá)到調(diào)控的目的。miR164家族是植物特有的，其中miR164b主要的靶標(biāo)基因是編碼NAC的轉(zhuǎn)錄因子，NAC參與調(diào)控植物生長發(fā)育過程以及對高鹽、干旱等非生物逆境脅迫響應(yīng)過程。因此，研究miR164及其靶基因NAC的功能對于揭示二者之間的調(diào)控方式及其在抗逆過程中的作用具有重要意義。本文以

2、毛竹（Phyllostachys edulis）為研究對象，分離了毛竹ped-miR164b相關(guān)序列和靶基因PeNAC1序列，在分析基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，通過RLM-5'RACE技術(shù)驗(yàn)證ped-miR164b對PeNAC1的作用位點(diǎn)，分析二者的表達(dá)模式，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)驗(yàn)證其功能，為今后竹子抗逆分子育種提供參考依據(jù)，主要結(jié)果如下:
　　(1)基因序列的獲得及生物信息學(xué)分析
　　從毛竹數(shù)據(jù)庫（BambooGDB，www.bamb

3、oogdb.org）中獲得miR164家族兩個(gè)成員，分別為ped-miR164a和ped-miR164b。根據(jù)ped-miR164b前體序列(PH01000543)設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到前體序列82 bp，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明該序列可形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且對應(yīng)成熟序列（5'-UGGAGAAGCAGGGCACGUGCU-3'）位于5'端臂上。ped-miR164b成熟序列保守性較高，與其它植物miR164家族成熟序列標(biāo)準(zhǔn)序列僅相差于

4、最后一個(gè)堿基序列(A→U)。
　　以玉米（Zea mays）Zm NA C1為誘餌，在毛竹全長cDNA數(shù)據(jù)庫中搜索獲得同源基因序列(FP095491)，特異性擴(kuò)增獲得其ORF序列，長度為867 bp，編碼一個(gè)288個(gè)氨基酸的蛋白。序列分析表明，在ORF的3'端包含與miR164b相匹配的靶點(diǎn)序列（5'-AGCAAGTGCCCTGCTTCTCCA-3'）; ORF編碼的蛋白與擬南芥（Arabidopsisthaliana）、水稻（O

5、ryza sativa）、玉米的NAC1具有較高的相似度（94％以上），包含NAC1特有的A、B、C、D和E五個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域，因此將該基因命名為PeNAC1。
　　(2)切割位點(diǎn)驗(yàn)證分析
　　采用RLM-5'RACE技術(shù)，驗(yàn)證ped-miR164b對其靶基因PeNAC1的切割作用。結(jié)果表明:PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收測序發(fā)現(xiàn)10個(gè)樣品中有9個(gè)的剪切位點(diǎn)在靶點(diǎn)序列的第10-11位堿基之間，說明ped-miR164b可在轉(zhuǎn)錄水平對其靶基因

6、PeNAC1進(jìn)行切割，調(diào)控其表達(dá)。這與在玉米中miR164對其靶基因ZmNA C1的切割位點(diǎn)相一致，進(jìn)一步證明植物miR164切割位點(diǎn)的保守性。
　　(3)基因時(shí)空表達(dá)分析
　　采用實(shí)時(shí)定量PCR方法對ped-miR164b及PeNAC1進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析，結(jié)果表明，二者均在根、莖、葉和鞘中表達(dá)，為組成型表達(dá)，且ped-miR164b在根中表達(dá)量最高，而PeNAC1則在根中表達(dá)量最低。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，NaCl(3

7、00 mmol·L-1)、低溫(4℃)和強(qiáng)光(1500μmol·m-2·s-1)處理后毛竹葉片中ped-miR164b的表達(dá)均下調(diào)，GA3(100μmol·L-1)處理后ped-miR164b表達(dá)量則上調(diào)，而在同樣處理?xiàng)l件下，PeNAC1的表達(dá)恰好呈現(xiàn)出與其完全相反的趨勢。由此表明，ped-miR164b及其靶基因PeNAC1可能響應(yīng)植物抗逆及激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。
　　(4)基因異位表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株表型分析
　　分別構(gòu)建ped

8、-miR164b前體的過量表達(dá)載體以及PeNAC1的正、反義植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)ped-miR164b的擬南芥植株子葉或者葉柄發(fā)生不同程度的融合，有的子葉則發(fā)育形成杯狀，有的蓮座葉發(fā)育不正常，如出現(xiàn)非對稱子葉、缺刻葉片、不規(guī)則葉片，有的根系生長明顯受到抑制，側(cè)根數(shù)量減少。轉(zhuǎn)正義PeNAC1的擬南芥植株，相對野生型植株，生長較快，側(cè)根數(shù)目相對較多;而轉(zhuǎn)反義PeNAC1的植株則生長相對較慢，個(gè)體矮小，有的株系則出現(xiàn)

9、與轉(zhuǎn)ped-miR164b植株相似的表型，即缺葉或者非對稱葉表型，同時(shí)側(cè)根數(shù)目也相對較少，有的株系根長度變短。
　　(5)轉(zhuǎn)基因植株抗逆性分析
　　分別對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行NaCl（300 mmol·L-1）和PEG6000(30％)處理，以野生型擬南芥為對照，統(tǒng)計(jì)成活率，同時(shí)進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)正義PeNAC1基因的轉(zhuǎn)基因植株成活率達(dá)到80-90％，熒光參數(shù)Fv/Fm下降趨勢較緩慢;而過表達(dá)ped-miR164

10、b和轉(zhuǎn)反義PeNAC1基因的轉(zhuǎn)植株成活率為20-30％，熒光參數(shù)Fv/Fm下降趨勢較快。由此表明，ped-miR164b及靶基因PeNAC1可能通過影響轉(zhuǎn)基因植株根的發(fā)育進(jìn)而影響其抗性。
　　(6)ped-miR164b前體上游啟動子序列分離及活性分析
　　經(jīng)過特異性擴(kuò)增獲得ped-miR164b前體上游啟動子區(qū)域序列(1，480bp)，通過在線平臺Plant CARE（http://bioinformatics.psb.u

11、gent.be/Webtools/plantcare/html/）分析結(jié)果表明，此序列包含啟動子基本作用元件，如TATA-box、CAAT-box等，此外還包括許多和逆境相關(guān)的響應(yīng)元件，如ARE、LTR和MBS等，這說明ped-miR164b可能參與調(diào)控植物逆境脅迫過程。構(gòu)建該啟動子區(qū)域序列與GUS基因融合的表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥，通過篩選抗性植株，進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株的根、莖和葉中均呈現(xiàn)藍(lán)色，表明該啟

12、動子能夠調(diào)控GUS報(bào)告基因的表達(dá)，具有生物活性，且為組成型啟動子。
　　MiR164家族和NAC轉(zhuǎn)錄因子家族均是植物特有的，本研究結(jié)果表明ped-miR164b及PeNAC1都是組成型表達(dá)，參與激素和非生物脅迫條件的應(yīng)答調(diào)節(jié)。在模式植物擬南芥中過量表達(dá)ped-miR164b及PeNAC1，均影響轉(zhuǎn)基因植株葉及根的形態(tài)建成。在干旱、鹽脅迫條件下，ped-miR164b和PeNAC1轉(zhuǎn)基因植株的生理指標(biāo)測定結(jié)果證明ped-miR164