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文檔簡介
1、背景:
miRNA是一類長度約為19~25個核苷酸的小分子單鏈非編碼RNA,通過與靶基因mRNA3'端非編碼區(qū)(3'-untranslated region,3'-UTR)特定序列的堿基互補結(jié)合,導(dǎo)致靶基因mRNA降解或抑制蛋白質(zhì)的翻譯過程,從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達。本課題組前期研究圍繞“miRNA-PXR-OATP1B1”通路開展,結(jié)果發(fā)現(xiàn) PXR的蛋白表達量受 miR-148a轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的影響,且可間接調(diào)控OATP
2、1B1的表達。我們通過生物信息學(xué)軟件Targetscan、miRBase、miRanda及RNA Hybrid預(yù)測,發(fā)現(xiàn)miR-206/miR-613種子序列與OATP1B1 mRNA3'-UTR互補配對,具有較高的特異性,且它們之間形成的二級結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。那么,miR-206/miR-613能否調(diào)控OATP1B1蛋白表達,其作用機制是否與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān),已引起了我們的高度關(guān)注。故而本研究擬借助分子生物學(xué)技術(shù),探究miR-206/miR
3、-613對 OATP1B1基因和蛋白表達的影響,闡明其作用機制,為OATP1B1轉(zhuǎn)運能力的改變而引起的藥物反應(yīng)個體差異研究提供新的思路。
目的:
研究miR-206/miR-613對HepG2細胞中OATP1B1的 mRNA及蛋白表達水平的影響;基于miRNA靶向作用OATP1B1 mRNA3'-UTR,深入探索miR-206/613影響OATP1B1表達的機制。
方法:
1.采用生物信息學(xué)軟件根
4、據(jù) miRNA種子序列與 OATP1B1 mRNA3'-UTR互補結(jié)合的方式及結(jié)合位點最小自由能預(yù)測和篩選出可能靶向作用于OATP1B1 mRNA3'-UTR的miRNAs;
2.分別向HepG2細胞中轉(zhuǎn)染 miR-206/miR-613擬似物(mimic)或抑制物(inhibitor),運用RT-qPCR方法檢測HepG2細胞中miR-206/miR-613表達水平,驗證過表達或抑制表達miR-206/miR-613的Hep
5、G2細胞細胞模型是否構(gòu)建成功;
3.分別向 HepG2細胞中轉(zhuǎn)染 miR-206/miR-613 mimic或 inhibitor,運用RT-qPCR和Western blot等分子生物學(xué)方法檢測OATP1B1 mRNA及蛋白表達水平,探究過表達或抑制表達miR-206/miR-613對HepG2細胞OATP1B1 mRNA和蛋白表達的影響;
4.采用雙熒光報告基因法,研究miR-206/miR-613作用于OATP
6、1B1表達的確切機制:首先,將OATP1B1 mRNA的3'-UTR序列克隆至pMIR-REPORT熒光素酶報告基因載體中,得到 pMIR/OATP1B1-WT報告質(zhì)粒,與miR-206/miR-613 mimic或inhibitor轉(zhuǎn)染至HEK293T或HepG2細胞中,檢測miR-206/miR-613對報告基因熒光素酶活性的影響;其次,以定點突變方式突變OATP1B1 mRNA3'-UTR上miR-206/miR-613的結(jié)合位點
7、,繼而克隆、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和檢測熒光素酶活性;再次,比較突變前后熒光素酶活性的差異,從而分析miR-206/miR-613對OATP1B1影響的作用位點;
5.數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析:各實驗組的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,用Graphpad Prisms v5.0軟件作圖,并用SPSS軟件進行單因素方差分析比較實驗組與對照組之間的差異性;統(tǒng)計結(jié)果以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義, P>0.05表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義。<
8、br> 結(jié)果:
1.通過Targetscan、miRBase、miRanda及RNA Hybrid等生物信息學(xué)軟件分析,發(fā)現(xiàn)miR-206/miR-613種子序列與OATP1B1 mRNA3'-UTR互補配對,具有較高的特異性,且它們之間形成的二級結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。
2. HepG2細胞中轉(zhuǎn)染miR-206 mimic作用48 h后,對照組與miR-206 mimic組miR-206相對表達水平分別為1.00±0.00
9、、1227.85±142.42,與對照組相比,miR-206表達水平上調(diào)了1227.85倍;而以miR-206 inhibitor作用HepG2細胞48 h后,對照組與miR-206 inhibitor組miR-206相對表達水平分別為1.00±0.00、0.48±0.13,即miR-206表達水平僅為對照組的0.48倍;與此相同,HepG2細胞中轉(zhuǎn)染miR-613 mimic作用48 h后,與對照組相比,miR-613表達水平上調(diào)了9
10、35.38倍;而以miR-613 inhibitor作用HepG2細胞48 h后,miR-613表達水平卻僅為對照組的0.67倍;由此可見,我們已成功建立了過表達或抑制表達miR-206/miR-613的HepG2細胞模型。
3. miR-206/miR-613 mimic轉(zhuǎn)染后的HepG2細胞中OATP1B1 mRNA相對表達水平分別為1.00±0.00、1.29±0.41、1.05±0.32,各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.
11、05),而 OATP1B1蛋白相對表達水平分別為1.00±0.02、0.75±0.02、0.61±0.01,與對照組相比下調(diào)24.7%、38.8%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。miR-206/miR-613 inhibitor轉(zhuǎn)染后的 HepG2細胞中 OATP1B1 mRNA相對表達表達水平分別為1.0±0.00、1.16±0.16、1.17±0.21,各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而OATP1B1蛋白相對表達水平分別
12、為1.00±0.06、1.25±0.07、1.38±0.08,與對照組相比上調(diào)25%、38.2%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
4.通過雙熒光報告基因?qū)嶒?,我們發(fā)現(xiàn)miR-206/miR-613 mimic可顯著抑制pMIR/ OATP1B1-WT報告基因熒光素酶活性,各組相對熒光素酶活性分別為1.00±0.03、0.65±0.05、0.70±0.03,與對照組相比熒光素酶活性分別下降35%和30%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義
13、(P<0.05);miR-206/miR-613 inhibitor可誘導(dǎo)熒光素酶活性,各組相對熒光素酶活性分別為1.00±0.04、1.33±0.12、1.33±0.12,與對照組相比熒光素酶活性分別增加33.1%和32.5%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而在OATP1B1 mRNA3'-UTR miR-206/miR-613結(jié)合位點突變的報告基因系統(tǒng)中, miR-206/miR-613 mimic和inhibitor對熒光素
14、酶活性均無影響,各組相對熒光素酶活性分別為1.00±0.05、1.15±0.14、1.03±0.175和1.00±0.01、0.96±0.04、1.00±0.09,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
結(jié)論:
1.本研究建立的過表達或抑制表達miR-206/miR-613的HepG2細胞模型,該模型用于基因和蛋白水平上的實驗研究具有良好的可重復(fù)性。
2. miR-206和miR-613對OATP1B1的蛋白表
15、達具有確切的調(diào)控作用,但對OATP1B1 mRNA的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義;提示miR-206和miR-613可能是在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控OATP1B1的蛋白表達。
3. miR-206/miR-613 mimic或inhibitor與OATP1B1 mRNA3'-UTR結(jié)合從而抑制或誘導(dǎo)pMIR/OATP1B1-WT報告基因的活性,當(dāng)結(jié)合位點突變后,miR-206/miR-613 mimic和inhibitor對報告基因的活性則無
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