過表達miR-148b對NSCLC細胞增殖和凋亡的影響和作用機制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　肺癌是一類嚴重危害人類身體健康和生命的常見惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率居高不下。肺癌重要成員之一的非小細胞肺癌是我國常見惡性腫瘤，許多患者在診斷時就已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移。近年來，在非小細胞肺癌（NSCLC）治療方面雖然涌現(xiàn)出了許多低毒有效的新藥物，但NSCLC患者的總生存時間仍無法得到明顯延長，故探索控制NSCLC的新方法具有重要的臨床意義?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，腫瘤的發(fā)生與發(fā)展常常伴隨著細胞生物學行為的異常改變。目前，在諸多

2、腫瘤中可檢測到異常表達甚至缺失的miRNA，這提示miRNA很可能具備促進腫瘤或者抑制腫瘤的功能，在腫瘤的進展中可能通過靶向調(diào)節(jié)原癌基因或抑癌基因來發(fā)揮一定的作用。其中，許多研究發(fā)現(xiàn)miR-148b在人類多種類型的腫瘤中呈低表達，并發(fā)揮類似抗癌基因的作用，然而， miR-148b對腫瘤進展的影響以及在非小細胞肺癌中潛在作用機制尚未得到充分探索。為了更好地了解miR-148b在非小細胞肺癌中的生物學意義，在前期研究中我們初步測定了miR-

3、148b在PC14/B和A549人類非小細胞肺癌細胞系中的功能，通過實時熒光定量PCR檢測肺癌患者與正常肺組織中miR-148b的表達，進行MTT細胞增殖實驗、平板克隆形成實驗、Transwell細胞侵襲實驗，發(fā)現(xiàn)miR-148b對NSCLC細胞株增殖、克隆形成能力以及侵襲能力均有抑制作用。此次，我們研究了miR-148b呈現(xiàn)過表達時對NSCLC細胞增殖和凋亡的影響，并進一步分析驗證了其可能存在的作用機制。
　　研究方法：

4、　　(1)重組慢病毒載體構(gòu)建，病毒包裝與滴度檢測：將基因 miR-148b克隆至慢病毒rLv-miR-148b載體，作為miR-148b過表達組，將干擾miR-148b的表達的克隆至慢病毒rLv-NC載體，作為陰性對照組rLv-NC，分別共轉(zhuǎn)染293T細胞，獲得高滴度的慢病毒濃縮液；
　　(2)分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染病毒 rLv-miR-148b、病毒 rLv-NC和未重組慢病毒 Lv-Blank于PC14/B和A549細胞系，獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞

5、株，實時熒光定量PCR測定各組細胞的miR-148b表達量；
　　(3) CCK-8法、平板克隆形成實驗、PI單染法細胞周期檢測、Annexin V-FITC/PI雙染色法細胞凋亡檢測和免疫印跡實驗測定改變miR148b的表達對NSCLC細胞增殖和凋亡的影響及其可能的作用機制。
　　研究結(jié)果：
　　(1)實時熒光定量PCR測定穩(wěn)轉(zhuǎn)后PC14/B和A549細胞系中miR-148b的表達量，空白對照組為：PC14/B-Bl

6、ank、A549-Blank，陰性對照組為：PC14/B-NC、A549-NC，miR-148b過表達組為：PC14/B-miR-148b、A549-miR-148b；
　　(2)穩(wěn)轉(zhuǎn)后PC14/B和A549細胞的CCK-8細胞增殖實驗和平板克隆形成測定顯示：與空白對照組相比，miR-148b的過表達顯著抑制PC14/B和A549細胞的增殖和集落形成，并且沉默miR-148b的表達可逆轉(zhuǎn)PC14/B和A549細胞中miR-148b

7、抑制細胞增殖和集落形成的作用；
　　(3) PC14/B和A549的細胞轉(zhuǎn)染后細胞周期分布顯示：與空白對照組相比，miR-148b過表達組，G2/M期細胞數(shù)明顯減少，而沉默miR-148b表達組，G2/M期細胞顯著增加；
　　(4) Annexin V-FITC/PI雙染色后，通過流式細胞儀分析并量化轉(zhuǎn)染后PC14/B和A549細胞的凋亡率，根據(jù)各組的早期凋亡率發(fā)現(xiàn)miR-148b過表達細胞的凋亡率高于空白對照組，而沉默mi

8、R-148b表達的細胞凋亡率低于空白對照組；
　　(5)免疫印記實驗分析顯示，與空白對照組比 miR-148b的過表達明顯降低 PC14/B和A549細胞中磷酸化JNK蛋白的表達，而JNK上游的刺激信號MKK4蛋白、MKK蛋白7和總的JNK蛋白的表達不受影響，并且沉默miR-148b的表達能夠重新激活JNK的磷酸化。
　　研究結(jié)論：
　　(1) miR-148b的過表達抑制NSCLC細胞增殖；
　　(2) miR