MiR-219-5p在肝細胞癌患者中的表達與其對增殖的作用和機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景與目的:
   肝癌是世界最常見的惡性腫瘤之一,全球范圍內(nèi)50%的肝癌患者發(fā)生在我國。肝細胞癌(HCC)是原發(fā)性肝癌中最常見的病理組織學(xué)類型,其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率都很高,死亡率在世界范圍內(nèi)占惡性腫瘤死亡率的第3位。同其它惡性腫瘤一樣,肝癌的發(fā)生發(fā)展涉及多種基因表達和結(jié)構(gòu)的異常。然而,肝細胞癌的分子病理機制較為復(fù)雜,目前仍不十分明確。近年來,發(fā)現(xiàn)了一種新的調(diào)控RNAs——microRNAs(miRNAs)。研究證實miRNAs的異常

2、表達參與肝細胞癌的分子病理進程。
   MiRNAs是一種全長僅有18~24個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA,通過與信使RNAs(mRNAs)的3'非編碼區(qū)(3'UTR)結(jié)合負向調(diào)節(jié)基因的表達。近來的研究表明多種miRNAs在各種病理進程中發(fā)揮重要作用,如腫瘤的增殖、分化和凋亡。在肝癌中也發(fā)現(xiàn)了多種異常表達的miRNAs,且異常表達的miRNAs通過調(diào)控靶標(biāo)mRNAs參與肝細胞癌的分子病理進程。根據(jù)靶標(biāo)基因生物學(xué)功能的不同,m

3、iRNA充當(dāng)著腫瘤抑制基因或癌基因的角色。研究指出miR-22、miR-29c、miR-101、miR-122a、miR-124、miR-125b、miR-142-3p、miR-199a-3p、miR-519d和miR-637等在肝細胞癌中表達降低,且參與肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展。相反,其它的miRNAs,如miR-29a和miR-191在肝細胞癌中表達增高。檢測腫瘤相關(guān)的特異miRNAs以及靶標(biāo)基因,能夠進一步明確腫瘤的發(fā)生機制,也許對新的

4、治療策略的探索也有重要意義。最近的研究指出miR-219在鱗狀細胞癌和成神經(jīng)管細胞瘤中表達降低。Izzotti等研究發(fā)現(xiàn)在肺組織的癌前病變中miR-219表達降低?;蛐酒治鲲@示在乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒相關(guān)的疾病中,如慢性肝炎和肝細胞癌,miR-219的表達較正常組織顯著降低。然而,miR-219在肝細胞癌中的作用仍不甚明確。在這個的研究中,我們將關(guān)注miR-219在肝細胞癌中的表達和功能。
   方法:
   一

5、.MiR-219-5p在肝細胞癌中的表達及其臨床意義
   1.肝細胞癌患者癌組織、癌旁組織及臨床病理參數(shù)的收集
   收集2001年~2008年南方醫(yī)院手術(shù)切除的肝細胞癌組織標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本83例,腫瘤組織經(jīng)病理檢查診斷均為原發(fā)性肝細胞癌。相對應(yīng)的癌旁組織距離腫瘤邊緣5cm。所有的組織標(biāo)本用10%福爾馬林固定,石蠟包埋?;颊咴谑中g(shù)前未接受過局部或系統(tǒng)治療。根據(jù)WHO的標(biāo)準(zhǔn)對組織分化進行分級,根據(jù)UICC/AJCC20

6、02版進行TNM分期。
   2.組織中miR-219-5p的檢測
   應(yīng)用TRIzol法提取組織中的總RNA,通過熒光定量PCR法檢測miR-219-5p的表達:莖環(huán)法進行RNA逆轉(zhuǎn)錄,SYBR(R)Green染料擴增cDNA。
   3.癌組織miR-219-5p表達的判定
   PCR實驗重復(fù)3次,取平均Ct值,以snRNAU6作為內(nèi)參,計算2-△△Ct值。MiR-219-5p在癌組織中的表達情況

7、以癌旁組織作為對照。數(shù)據(jù)經(jīng)log2轉(zhuǎn)換,當(dāng)<-1.0時定義為表達下降;當(dāng)>-1.0時定義為表達正常/增加。
   二.上調(diào)miR-219-5p表達對肝細胞癌細胞株增殖的影響
   1.細胞株的培養(yǎng)條件
   人肝細胞癌細胞株Huh-7、MHCC-97H、MHCC-97L、HepG2、HCCLM6,以及人肝細胞株HL-7702使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,至37℃、5%CO2、相對濕度95%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

8、
   2.細胞株中miR-219-5p的檢測
   應(yīng)用TRIzol法提取細胞株中的總RNA,通過熒光定量PCR法檢測miR-219-5p的表達:莖環(huán)法進行RNA逆轉(zhuǎn)錄,SYBR(R)Green染料擴增cDNA。
   3.MiR-219-5pmimics轉(zhuǎn)染Huh-7和HepG2細胞
   采用Lipofectamine2000法轉(zhuǎn)染細胞株,mimics轉(zhuǎn)染的終濃度為50nM,轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下觀察細

9、胞轉(zhuǎn)染效率,并通過熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)染后細胞miR-219-5p的表達情況。
   4.上調(diào)miR-219-5p表達對Huh-7和HepG2細胞增殖的影響
   轉(zhuǎn)染miR-219-5pmimics后,通過CCK-8法、克隆形成實驗、裸鼠皮下成瘤實驗、細胞周期及細胞凋亡實驗,觀察細胞增殖能力、細胞周期和凋亡的變化。
   三.下調(diào)miR-219-5p表達對MHCC-97L細胞增殖的影響
   1.Mi

10、R-219-5pinhibitors轉(zhuǎn)染MHCC-97L細胞
   采用Lipofectamine2000法轉(zhuǎn)染細胞株,inhibitors的終濃度為100nM,通過熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)染后細胞miR-219-5p的表達情況。
   2.下調(diào)miR-219-5p表達對MHCC-97L細胞體外增殖的影響
   轉(zhuǎn)染miR-219-5pinhibitors后,通過CCK-8法、克隆形成實驗及細胞周期實驗,觀察細胞增

11、殖能力和細胞周期的變化。
   四.肝細胞癌中miR-219-5p對GPC3表達的調(diào)控
   1.構(gòu)建野生型GPC33'UTR(wGPC33'UTR)和突變型GPC33'UTR(mGPC33'UTR)質(zhì)粒。
   2.雙熒光素酶活性檢測:miR-219-5pmimics/m-NCs與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞,48小時后檢測雙熒光素酶活性變化差異。
   3.通過熒光定量PCR法及瓊脂糖凝膠電泳檢測H

12、epG2和Huh-7細胞轉(zhuǎn)染mimics后GPC3mRNA的表達的變化。
   4.通過westernblot法檢測HepG2細胞轉(zhuǎn)染mimics后,GPC3蛋白表達的變化。
   5.在前面83例中選取明確GPC3蛋白表達的45例肝細胞癌患者,統(tǒng)計分析miR-219-5p表達與GPC3蛋白表達的吻合情況。
   結(jié)果:
   一.MiR-219-5p在肝細胞癌中的表達及其臨床意義
   1.癌組

13、織miR-219-5p平均2-△△Ct值為0.16±0.17,癌旁組織miR-219-5p平均2-△△Ct值為0.41±0.23,差值有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),癌組織中miR-219-5p的表達水平顯著降低。
   2.通過log2轉(zhuǎn)換,83例肝細胞癌患者中,51例(61.45%)miR-219-5p表達降低。
   3.單因素分析顯示:①腫瘤最大徑≥5cm的肝細胞癌患者miR-219-5p表達顯著低于腫瘤最大徑<

14、5cm的患者(P<0.05);②組織分化差的肝細胞患者miR-219-5p表達顯著低于組織分化較好的患者(P<0.05);③在不同性別、年齡、血清HBsAg、血清AFP、肝硬化情況、TNM分期中,miR-219-5p表達水平無顯著性差異(P>0.05)。
   4.逐步Logistic回歸分析結(jié)果顯示:對miR-219-5p表達有顯著影響的臨床病理參數(shù)是組織分化程度(P<0.05),組織分化差的患者miR-219-5p表達降低的

15、危險性是分化好的患者的4.419倍。
   5.Kaplan-Meier法和Log-ranktest分析顯示:miR-219-5p高表達的肝細胞患者中位生存時間為30.0個月(95%CI:18.934~41.066),miR-219-5p低表達的肝細胞癌患者中位生存時間為13.0個月(95%CI:9.895~16.105),miR-219-5p表達減少患者預(yù)后差(P=0.005,Log-ranktest)。
   6.肝

16、細胞癌患者生存時間影響的多因素分析顯示:變量miR-219-5p水平、血清AFP、腫瘤大小、有無肝硬化及TNM分期是肝細胞癌患者生存的影響因素(P<0.05)。5個變量的HR值均大于1,表明:miR-219-5p表達水平低的患者死亡風(fēng)險較表達水平高的患者大;血清AFP陽性、腫瘤最大徑≥5cm、存在肝硬化、TNM分期晚的患者,死亡風(fēng)險更大。
   二.上調(diào)miR-219-5p表達對肝細胞癌細胞株增殖的影響
   1.與正常

17、肝細胞HL-7702相比,miR-219-5p在Huh-7、HepG2和HCCLM6中表達顯著降低(P<0.05)。而MHCCL-97H和MHCCL97L細胞miR-219-5p的表達與HL-7702細胞相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
   2.熒光顯微鏡下可見Huh-7和HepG2細胞轉(zhuǎn)染效果理想,熒光定量PCR檢測Huh-7和HepG2細胞mimics轉(zhuǎn)染后miR-219-5p的表達,結(jié)果示mimics轉(zhuǎn)染組細胞miR-

18、219-5p表達較空白組和對照組顯著升高(P<0.05)。
   3.CCK-8法檢測Huh-7和HepG2細胞轉(zhuǎn)染mimics后體外增殖能力的變化,結(jié)果示:48h和72h時,mimics轉(zhuǎn)染組細胞增殖能力顯著低于對照組細胞(P<0.05);兩株細胞不同處理組與培養(yǎng)時間存在顯著的交互效應(yīng)(P<0.001),兩株細胞不同處理組間細胞增殖能力的差異隨時間發(fā)生變化,在72h時更為顯著。
   4.細胞克隆形成實驗研究顯示mim

19、ics組HepG2細胞克隆形成率較m-NCs組顯著降低(P<0.001)。
   5.裸鼠皮下成瘤實驗顯示,mimics轉(zhuǎn)染后皮下腫瘤的重量較對照組顯著減輕(P=0.025);兩組間腫瘤體積有顯著性差異(P=0.001),兩組間體積大小的差異隨著飼養(yǎng)天數(shù)的增加而增大(P=0.002)。
   6.細胞周期檢測的結(jié)果顯示:與對照組細胞相比,mimics組HepG2細胞G1期比例顯著增加(P=0.009),S期比例顯著減低(

20、P=0.018)。
   7.細胞凋亡檢測結(jié)果顯示:兩組間細胞凋亡在48h和72h時均無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.288);不同培養(yǎng)時間之間的細胞凋亡率有顯著性差異(P<0.001);不同培養(yǎng)時間之間細胞凋亡率的差異與處理因素?zé)o關(guān)(P=0.585)。
   三.下調(diào)miR-219-5p表達對MHCC-97L細胞增殖的影響
   1.熒光定量PCR檢測MHCC-97L細胞inhibitors轉(zhuǎn)染后miR-219-5p的表

21、達,結(jié)果示inhibitors轉(zhuǎn)染組細胞miR-219-5p表達較空白組和對照組顯著降低(P<0.05)。
   2.CCK-8法檢測MCHH-97L細胞轉(zhuǎn)染inhibitors后體外增殖能力的變化,結(jié)果示:72h和96h時,inhibitors轉(zhuǎn)染組細胞增殖水平顯著高于對照組細胞(P<0.05);兩處理組細胞增殖水平隨著培養(yǎng)時間的增加而顯著增高(P<0.001);兩處理組間增殖水平的差異隨著培養(yǎng)時間的增加而增大(P=0.002

22、)。
   3.通過平板克隆形成實驗分析下調(diào)miR-219-5p對MHCC-97L細胞增殖的影響,結(jié)果顯示:inhibitors組MHCC-97L細胞克隆形成率較i-NCs組高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。
   4.細胞周期檢測的結(jié)果顯示:與對照組細胞相比,inhibitors組MHCC-97L細胞G1期比例顯著減少(P=0.002),S期比例顯著增加(P<0.001)。
   四.肝細胞癌中miR-2

23、19-5p對GPC3表達的調(diào)控
   1.成功構(gòu)建野生型GPC33'UTR(wGPC33'UTR)和突變型GPC33'UTR(mGPC33'UTR)質(zhì)粒,并通過測序鑒定。
   2.MiR-219-5pmimics/m-NCs與載體共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞,48h檢測雙熒光素酶活性,結(jié)果顯示:空載psi-CHECH2質(zhì)粒的實驗中,miR-219-5pmimics組與m-NCs組活性倍數(shù)無顯著差異(P=0.098);wG

24、PC33'UTR的實驗中,miR-219-5pmimics組與m-NCs組相比,活性倍數(shù)顯著下降(P=0.004);mGPC33'UTR的實驗中,miR-219-5pmimics組與m-NCs組活性倍數(shù)無顯著差異(P=0.515),表明miR-219-5p可與wGPC33'UTR結(jié)合。
   3.轉(zhuǎn)染mimics后,通過熒光定量PCR法檢測HepG2和Huh-7細胞GPC3mRNA的表達水平,結(jié)果提示轉(zhuǎn)染48小時后,HepG2和

25、Huh-7細胞GPC3mRNA的表達均顯著下降(P<0.01)。
   4.Westernblot檢測提示轉(zhuǎn)染96h后HepG2細胞GPC3蛋白表達明顯下降。
   5.分析45例肝細胞癌患者中miR-219-5p表達與GPC3表達的關(guān)系,結(jié)果表明:McNemar檢驗示miR-219-5p表達正常/上調(diào)與GPC3表達“-/+”的情況無顯著差異(P=0.302);κ檢驗示miR-219-5p表達正常/上調(diào)與GPC3表達“-

26、/+”的吻合度有統(tǒng)計學(xué)意義,但吻合度較弱(κ=0.308,P<0.05)。
   結(jié)論:
   1.MiR-219-5p在肝細胞癌癌組織中表達下降;其表達水平與患者腫瘤組織分化程度有關(guān),組織分化程度低是miR-219-5p表達降低的因素;miR-219-5p低表達的肝細胞癌患者生存時間短于miR-219-5p高表達的患者;miR-219-5p水平與血清AFP、腫瘤大小、有無肝硬化、TNM分期是肝細胞癌患者生存的影響因素。

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