PHF19在人肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制中的作用及其受MiR-195-5p調(diào)節(jié)的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本課題旨在研究和探討miR-195是否對(duì)PHF19有調(diào)控作用，闡述miR-195對(duì)HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中分子生物學(xué)機(jī)制的影響，主要從細(xì)胞分子水平和動(dòng)物整體水平觀察PHF19及調(diào)控其表達(dá)的miRNA對(duì)HCC的影響并探討其相關(guān)的機(jī)制，為尋找HCC新的治療靶點(diǎn)提供重要依據(jù)。
　　方法：
　　一、觀察HCC組織中PHF19的表達(dá)情況
　　1.首先收集30例臨床HCC癌癥組織和配對(duì)癌旁組織標(biāo)本，選取癌旁組織為對(duì)照

2、組，癌組織為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)組織進(jìn)行RNA提取，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)30例人HCC癌組織和配對(duì)癌旁組織中PHF19 mRNA水平的表達(dá)。
　　二、觀察PHF19對(duì)肝癌細(xì)胞系的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響
　　1.通過(guò)構(gòu)建PHF19慢病毒過(guò)表達(dá)載體，并將載體轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中，并利用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)對(duì)提取的細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，驗(yàn)證其慢病毒PHF19載體的轉(zhuǎn)染效果。
　　2.觀察的

3、實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的HepG2細(xì)胞通過(guò)Transwell膜的數(shù)量，觀察PHF19對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響。
　　3.利用CCK-8試劑處理鋪板于96孔板的LV-PHF19 HepG2細(xì)胞和LV-Mock HepG2細(xì)胞，檢測(cè)二者的細(xì)胞增殖效果的差異，觀察PHF19對(duì)HepG2細(xì)胞增殖效率的影響。
　　4.對(duì)培養(yǎng)的LV-PHF19 HepG2細(xì)胞和LV-Mock HepG2細(xì)胞進(jìn)行收集，固定，染色后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)，觀

4、察PHF19對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的調(diào)控作用。
　　三、觀察內(nèi)源性miRNA miR-195-5p對(duì)PHF19的調(diào)控作用
　　1.通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站(TargetScan，miRanda，RNA22，miRDB，miR-Gen，PITA，EMBL-EBI，starBase，PicTar，RNAhybrid and miRBase)分析與PHF19特定序列靶向結(jié)合的miRNAs，并通過(guò)熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)合位點(diǎn)。
　　2.在

5、HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-195-5p mimic，通過(guò)蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)PHF19蛋白水平表達(dá)情況。
　　3.通過(guò)收集30例臨床HCC病人癌組織和配對(duì)癌旁組織標(biāo)本，利用RT-RCR檢測(cè)組織中miR-195-5p表達(dá)情況。
　　四、觀察miR-195-5p對(duì)肝癌細(xì)胞系的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響
　　1.通過(guò)構(gòu)建miR-195-5p慢病毒過(guò)表達(dá)載體，并將載體轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中

6、。用Transwell小室觀察過(guò)表達(dá)miR-195-5p HepG2的處理組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞的侵襲及遷移作用的差異。觀察miR-195-5p對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲性的影響。
　　2.利用CCK-8試劑處理鋪板于96孔板的LV-miR-195-5p HepG2細(xì)胞和LV-Mock HepG2細(xì)胞，檢測(cè)二者的細(xì)胞增殖率的差異，觀察miR-195-5p對(duì)HepG2細(xì)胞增殖效率的影響。
　　五、觀察PHF19和miR-195-5p對(duì)裸

7、鼠成瘤作用的影響
　　1.分別將處理組LV-PHF19 HepG2細(xì)胞、LV-miR-195-5p細(xì)胞HepG2，對(duì)照組LV-Mock HepG2細(xì)胞配置成細(xì)胞懸液，注射到裸鼠體內(nèi)，喂養(yǎng)并每3天稱重，2周后解剖腫瘤組織進(jìn)行稱重，觀察PHF19及miR-195-5p的對(duì)成瘤效果的影響。
　　結(jié)果：
　　一、觀察HCC癌組織中PHF19的表達(dá)情況
　　1.收集南方醫(yī)院臨床30例肝癌癌癥組織和配對(duì)癌旁組織標(biāo)本，選取癌旁

8、組織為對(duì)照組，癌組織為處理組。提取組織RNA，通過(guò)RT-PCR分別檢測(cè)組織中PHF19的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，PHF19在癌組織表達(dá)顯著上調(diào)(t=-3.909，P=0.001)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　一、觀察PHF19對(duì)肝癌細(xì)胞系的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響
　　1.本研究通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)PHF19的慢病毒包裝質(zhì)粒載體，并將載體轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立實(shí)驗(yàn)組LV-PHF19 HepG2細(xì)胞

9、及對(duì)照組LV-Mock HepG2細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)染PHF19的肝癌細(xì)胞株中的總蛋白，并利用蛋白免疫印跡技術(shù)(Western blot)對(duì)提取的細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證，結(jié)果顯不:PHF19過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞組轉(zhuǎn)染效果顯著高于對(duì)照組，組間對(duì)比有顯著性差異(F=50.43，P＜0.001)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.利用經(jīng)典的Transwell小室實(shí)驗(yàn)，觀察穩(wěn)定過(guò)表達(dá)PHF19的肝癌細(xì)胞株侵襲性是否受到增強(qiáng)。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，穩(wěn)

10、定過(guò)表達(dá)PHF19后肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力都顯著增強(qiáng)，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(invasion:t=-8.736,P＜0.001; migration: t=-20.476，P＜0.001)。
　　3.通過(guò)CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)PHF19可提高肝癌細(xì)胞的增殖能力，24小時(shí)(F=13.958，P=0.001)和48小時(shí)(F=20.582，P＜0.001)細(xì)胞增殖能力都顯著增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

11、　　4.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PHF19過(guò)表達(dá)后對(duì)肝癌細(xì)胞周期和凋亡的影響。結(jié)果顯示，與LV-Mock HepG2細(xì)胞相比，LV-PHF19 HepG2細(xì)胞處于G1期細(xì)胞數(shù)目減少(F=263.311，P＜0.001)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;處于S期細(xì)胞數(shù)目增多(F=249.19，P＜0.001)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而G2M期無(wú)顯著性差異(F=0.175,P=0.679)，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示:與LV-MockHepG2細(xì)胞相比，LV-P

12、HF19 HepG2細(xì)胞的細(xì)胞凋亡比率明顯減少(t=-11.724，P＜0.001)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明PHF19在HCC病理過(guò)程中具有重要作用。
　　三、觀察調(diào)控肝癌過(guò)程中PHF19的內(nèi)源性miRNA
　　1.為進(jìn)一步研究與PHF19結(jié)合的miRNA，我們通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站(TargetScan，miRanda，RNA22，miRDB，miR-Gen，PITA，EMBL-EBI，starBase,PicTar，RNAhyb

13、rid and miRBase)分析與PHF19靶向結(jié)合的miRNAs，并通過(guò)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果顯示PHF19的3'UTR與miR-195-5p區(qū)存在互補(bǔ)配對(duì)序列。
　　2.在HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染has-miR-195-5p mimic，通過(guò)蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Westernblot)檢測(cè)PHF19蛋白水平表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，has-miR-195-5p可明顯下調(diào)PHF19的蛋白水平表達(dá)，兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

14、F=32.033，P＜0.001)。
　　3.對(duì)所收集臨床30例HCC病人癌組織和配對(duì)癌旁組織標(biāo)本，提取其RNA，利用RT-RCR檢測(cè)miR-195-5p基因水平表達(dá)情況，結(jié)果顯示癌組織中miR-195-5p表達(dá)顯著低于對(duì)照組(t=6.67，P=0.001)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。驗(yàn)證了miR-195-5p與PHF19表達(dá)呈相反變化趨勢(shì)。
　　四、觀察miR-195-5p對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響
　　1.構(gòu)建m

15、iR-195-5p慢病毒過(guò)表達(dá)載體，并將載體轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞HepG2中。通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-195-5p可顯著抑制肝癌細(xì)胞的體外侵襲(t=11.490，P＜0.001)和轉(zhuǎn)移能力(t=11.355，P＜0.001)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組，過(guò)表達(dá)miR-195-5p后24小時(shí)HepG2細(xì)胞的增殖活力(F=13.489，P=0.001)和48小時(shí)(F=16.98

16、8，P=0.000)細(xì)胞增殖能力均有顯著下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　五、觀察PHF19和miR-195-5p對(duì)裸鼠成瘤作用的影響
　　1.與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，注射表達(dá)慢病毒空載載體肝癌細(xì)胞的對(duì)照組中裸鼠體內(nèi)瘤塊并未明顯變化，而注射PHF19過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞成瘤作用顯著高于對(duì)照組(t=6.14，P＜0.001)，注射miR-195-5p過(guò)表達(dá)組肝癌細(xì)胞則成瘤作用顯著低于對(duì)照組(t=-4

17、.552，P＜0.001)，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明:PHF19具有成瘤作用，而miR-195-5p具有抑瘤作用。
　　結(jié)論：
　　1.PHF19在肝癌組織中表達(dá)明顯高于配對(duì)癌旁組織，與肝癌發(fā)展相關(guān)。
　　2.過(guò)表達(dá)PHF19可明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和生長(zhǎng)，并抑制細(xì)胞凋亡;3.miR-195-5p通過(guò)靶向調(diào)控PHF19的轉(zhuǎn)錄，并下調(diào)PHF19的表達(dá);
　　4.miR-195-5p在肝癌組織中表達(dá)明顯低于