癌基因DJ-1在人肝細(xì)胞癌中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文癌基因DJ-1在人肝細(xì)胞癌中的作用及其機(jī)制研究姓名：劉順?lè)忌暾?qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：外科學(xué)（普外）指導(dǎo)教師：易繼林2011-04華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文 3第二部分 第二部分 DJ-1 在人肝癌細(xì)胞株的表達(dá)及其 在人肝癌細(xì)胞株的表達(dá)及其 shRNA 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 HepG2細(xì)胞系的建立 細(xì)胞系的建立 目的 目的: 檢測(cè) DJ- 1 在人肝

2、癌細(xì)胞株的表達(dá)，構(gòu)建針對(duì) DJ- 1 的小發(fā)夾 RNA（small hairpin RNA, shRNA）真核表達(dá)載體，獲取干擾 DJ- 1 表達(dá)的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人肝癌 HepG2細(xì)胞，穩(wěn)篩后挑選亞克隆細(xì)胞系。 方法 方法: 在不同的人肝癌細(xì)胞株中，應(yīng)用 Western Blot 及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè) DJ- 1的表達(dá)水平及細(xì)胞定位； 設(shè)計(jì)干擾 DJ- 1 表達(dá)的 shRNA 序列結(jié)構(gòu)， 構(gòu)建 RNA 干擾 （RNA interfer

3、ence ，RNAi）真核表達(dá)載體 pGenesil- 1.1 質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)酶切、測(cè)序鑒定；干擾質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞 HepG2，經(jīng) G418 持續(xù)壓力選擇和有限稀釋法獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系；利用半定量 RT- PCR 及 Western Blot 分別檢測(cè)篩選亞克隆細(xì)胞系的mRNA 和蛋白表達(dá)。 結(jié)果 結(jié)果: DJ- 1 在人肝癌細(xì)胞株：HepG2、MHCC- 97L、MHCC- 97H、SMMC- 7721 及Huh- 7

4、 中高表達(dá)，且不同肝癌細(xì)胞株中 DJ- 1 表達(dá)存在差異（P＜0.05） ，但在對(duì)照組人胚胎肝細(xì)胞 L02 中表達(dá)缺失。激光共聚焦顯示，DJ- 1 表達(dá)主要定位于肝癌細(xì)胞胞質(zhì)；合成并構(gòu)建 DJ- 1 shRNA 質(zhì)粒載體， 雙酶切后電泳測(cè)序證實(shí) DJ- 1 干擾序列及讀碼框完全正確；成功篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的 HepG2 亞克隆細(xì)胞系，熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光，半定量 RT- PCR 檢測(cè)顯示干擾質(zhì)粒明顯抑制 DJ- 1 mRNA

5、表達(dá)，Western Blot檢測(cè) DJ- 1 蛋白抑制率為 98.78%（P＜0.05）。 結(jié)論 結(jié)論: DJ- 1 在人肝癌細(xì)胞株胞質(zhì)高表達(dá)，且其表達(dá)程度與肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)特性相關(guān)；成功構(gòu)建 DJ- 1 shRNA 真核表達(dá)載體，建立干擾質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 HepG2 細(xì)胞系亞細(xì)胞克隆，為以 DJ- 1 基因?yàn)榘悬c(diǎn)的人肝癌基因治療的理論研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞 關(guān)鍵詞: DJ- 1；RNA 干擾；肝細(xì)胞癌；生物學(xué)特性；腫瘤發(fā)生。