NuSAP1在肝細胞癌中的表達及其與肝細胞癌復發(fā)的關系.pdf

1、背景：
　　 肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是常見、高發(fā)的惡性腫瘤之一，肝細胞癌術后的高復發(fā)率成為影響其生存率和預后的最主要因素之一。但其根本的病因及機制尚不明了。深入研究原發(fā)性肝癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學基礎，及早預測原發(fā)性肝癌復發(fā)的危險性，從而有效改善原發(fā)性肝癌病人的預后，在當前有著非常重要的現實意義。核仁紡錘體相關蛋白1(nucleolarspindle-associated prote

2、in1，NuSAP1)是一種微管合蛋白，在紡錘體組裝中發(fā)揮重要功能，是保證細胞周期正常進行的重要調控分子。NuSAP1的mRNA水平和蛋白水平受到嚴格的調控，在細胞周期進程中呈現周期性變化。轉錄因子E2F家族在控制細胞周期的進展中起關鍵作用，NuSAP1基因的啟動子區(qū)域含有E2F的結合位點，E2F1和E2F結合位點結合后可明顯促進NuSAP1的轉錄。近年來研究發(fā)現在許多其它腫瘤中存在NuSAP1的過表達，它們的表達水平往往和腫瘤的侵襲性

3、及預后有關。有關NuSAP1在原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用以及與腫瘤侵襲性、預后的關系還沒有相關的報道。
　　 目的：
　　 鑒于NuSAP1家族在細胞周期中的重要作用，其功能的紊亂與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉移復發(fā)可能存在著密切關系，本實驗將從細胞水平和組織水平研究NuSAP1在肝細胞癌中的表達，分析NuSAP1在肝細胞癌中表達的臨床意義及其與E2F1的關系，探討NuSAP1在肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展和復發(fā)轉移過程中的作用及其分子機

4、制。
　　 方法：
　　 1.收集手術切除的新鮮肝細胞癌組織和相應的非癌組織標本，采用RT-PCR、熒光定量PCR檢測癌和非癌組織標本中NuSAP1的mRNA表達水平，免疫組織化學染色檢測癌和非癌組織標本中NuSAP1、E2F1蛋白表達水平，分別分析NuSAP1、E2F1在肝細胞癌中的表達與相關臨床病理特征及預后的關系;并探討E2F1在肝細胞癌中的表達及其與NuSAP1表達的關系。
　　 2.采用人高轉移肝細胞癌

5、細胞株HCCLM3，利用SiRNA定向抑制NuSAP1的表達，采用熒光定量PCR方法檢測抑制前后HCCLM3細胞株中NuSAP1mRNA表達的變化;采用Western blotting方法檢測抑制前后HCCLM3細胞株中NuSAP1蛋白表達的變化;使用Freshney計數板計量細胞數目的變化;MTS和Edu法檢測細胞增殖活性的變化;transwell小室檢測細胞遷移能力和細胞侵襲能力的變化;流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡的變化;分析其表達

6、對肝細胞癌細胞生物學特性的影響;
　　 3.采用人高轉移肝細胞癌細胞株MHCC97H，利用SiRNA定向抑制E2F1的表達;采用熒光定量PCR方法檢測抑制前后MHCC97H細胞株中NuSAP1mRNA表達的變化;采用Western blotting方法檢測抑制前后MHCC97H細胞株中NuSAP1蛋白表達的變化;研究在肝細胞癌細胞株中E2F1的表達對NuSAP1表達的調節(jié)作用。
　　 結果：
　　 1.無論是核酸

7、水平還是蛋白水平，NuSAP1在肝細胞癌組織中的表達均明顯高于相應的非癌組織(P＜0.05)。單因素分析表明:NuSAP1 mRNA和蛋白的表達均與TNM分期、巴塞羅那分期、淋巴結轉移、早期復發(fā)、有無癌栓和病理分化相關(P＜0.05); NuSAP1 mRNA的表達與血清AFP相關，而NuSAP1蛋白的表達與腫瘤大小、肝硬化相關(P＜0.05);多因素逐步logistic回歸分析表明:NuSAP1蛋白的表達是早期復發(fā)的獨立影響因素(P＜

8、0.05)。生存分析表明NuSAP1在肝細胞癌組織中的高表達與肝細胞癌患者預后差相關(X2=5.939，P=0.015)。肝細胞癌患者術后的無瘤生存期與NuSAP1蛋白表達的高低相關(Kaplan-Meier, log-rank test, P＜0.05)。
　　 2.E2F1蛋白在肝細胞癌組織中的表達明顯升高(P＜0.05);肝細胞癌組織中的E2F1蛋白表達升高與病理分化、早期復發(fā)、TNM分期及巴塞羅那分期相關(P＜0.05)

9、;生存分析表明E2F1在肝細胞癌組織中的高表達也與肝細胞癌患者預后差相關(X2=8.952，P=0.003)。肝細胞癌患者術后的無瘤生存期也與E2F1蛋白表達的高低相關（Kaplan-Meier，log-rank test，P＜0.05）。并且E2F1與NUSAP1蛋白的表達呈正相關的關系（P＜0.05）;
　　 3.在肝細胞癌細胞株的抑制實驗中，抑制HCCLM3細胞株NuSAP1的表達可明顯降低肝細胞癌的細胞數目的增加、抑制細

10、胞增殖活性、細胞移動性及細胞侵襲性、促進G2/M期轉化、促進細胞凋亡等（P＜0.05）;抑制MHCC97H細胞株E2F1的表達可明顯降低NuSAP1的表達量(P＜0.05)。
　　 結論：
　　 1、NuSAP1在肝細胞癌組織中存在過表達，NuSAP1在肝細胞癌中的表達與肝細胞癌患者的早期復發(fā)有關，NuSAP1高表達者預后差。
　　 2、E2F1在肝細胞癌組織中的表達明顯升高，并且與NuSAP1的表達存在正相關，