星狀細(xì)胞及其相關(guān)炎癥分子與肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的關(guān)系研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見的惡性腫瘤，占整個(gè)肝癌的70-85％和全世界癌癥死亡原因的第三位。在我國(guó)，自20世紀(jì)90年代，其已發(fā)展成第二位的癌癥殺手。高死亡率通常與早期診斷和治療選擇的局限性有關(guān)。事實(shí)上，HCC早期臨床表現(xiàn)的隱蔽性、特異監(jiān)測(cè)標(biāo)志的缺乏和現(xiàn)有治療策略的不足均限制了其預(yù)后的進(jìn)一步改善。而目前即使采取最有效的手術(shù)根治性切除，5年的術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍超過60％。因此，如何準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)

2、預(yù)后、降低患者的術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，進(jìn)行有效的靶向干預(yù)治療，已經(jīng)成為亟待解決的問題。
　　大量證據(jù)顯示，HCC是一個(gè)典型的炎癥相關(guān)的癌癥，主要由于受肝炎病毒感染和肝硬化所致。HCC的慢性炎癥是復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境的重要組成之一，包括大量炎癥/免疫細(xì)胞和介質(zhì)。因此，在很大程度上，HCC轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為和惡性預(yù)后可能被局部的炎癥狀態(tài)所決定和影響。一些證據(jù)提示，在肝癌形成過程中，炎癥/免疫細(xì)胞活化，并相互協(xié)作，獲得促瘤活性，從而導(dǎo)致腫瘤的惡性后果

3、。就此而言，這些炎癥/免疫細(xì)胞和它們所表達(dá)的一些關(guān)鍵介質(zhì)，可能提供了HCC靶向治療的靶點(diǎn)。而值得關(guān)注的是，肝星狀細(xì)胞(HSCs)活化后，能展示其多變的表型和致纖維化的特性。HSCs在腫瘤微環(huán)境中的作用已經(jīng)開始獲得廣泛關(guān)注。有研究認(rèn)為，在腫瘤微環(huán)境中，HSCs是一種被癌細(xì)胞旁分泌因子刺激后，分化為癌相關(guān)肌成纖維細(xì)胞(CAMFs)的竇周成纖維細(xì)胞。一方面，HSCs中的某些活化信號(hào)，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)和血小

4、板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)在腫瘤發(fā)展和纖維化過程中都起了重要作用。另一方面，HSCs被腫瘤細(xì)胞直接誘導(dǎo)活化后，通過腫瘤一間質(zhì)相互作用的分子網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)血管形成、侵襲和轉(zhuǎn)移。雖然我們已獲知上述這些關(guān)于HSCs在腫瘤發(fā)展中所涉及到的機(jī)制，但關(guān)于HSCs促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的本質(zhì)和調(diào)節(jié)仍然知之甚少。
　　在本項(xiàng)研究中，我們首先從肝癌微環(huán)境中HSCs的水平，利用組織和基因微陣列技術(shù)，比較分析了癌旁HSCs與對(duì)應(yīng)的肝癌CAMFs的全基因表達(dá)譜差

5、異，以及幾個(gè)最具特征的HSCs的表型標(biāo)志在HCC組織中的表達(dá)水平和患者轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的聯(lián)系;接著，我們以HSCs基因表達(dá)譜的分析結(jié)果為基礎(chǔ)，從中篩選出差異表達(dá)明顯的炎癥因子，如TREM-1，作為研究對(duì)象，探討了其作為功能基因，協(xié)同HSCs促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷徙的機(jī)制，并建立了TREM-1與HCC患者預(yù)后的關(guān)系;最后，通過HSCs基因表達(dá)譜，我們發(fā)現(xiàn)了IL-17受體在HSCs中表達(dá)。為進(jìn)一步了解HSCs與炎癥/免疫細(xì)胞之間的關(guān)系，我們研究了腫瘤活化的

6、HSCs和IL-17+CD4+T細(xì)胞之間的相互作用，從而在一定程度上驗(yàn)證了腫瘤微環(huán)境中各種炎癥/免疫細(xì)胞間具有相互“交流”，促腫瘤發(fā)展的作用和能力。
　　第一部分免疫微環(huán)境中腫瘤活化肝星狀細(xì)胞的基因表達(dá)譜研究
　　本研究旨在通過HSCs的基因譜特征和表型分析，探討其在肝癌局部微環(huán)境中的表型變化、數(shù)目、分布部位和基因表達(dá)水平的差異，從而尋找針對(duì)HBV相關(guān)性HCC的預(yù)后和治療靶點(diǎn)有關(guān)的有效信息，以進(jìn)一步研究以HSCs為代表的間質(zhì)

7、細(xì)胞在免疫微環(huán)境和肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中所起的作用。
　　本研究中，我們隨機(jī)選取224例2007年在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科行根治性手術(shù)切除的HBV相關(guān)的HCC患者。首先，我們利用免疫組織化學(xué)和細(xì)胞定量的方法評(píng)價(jià)了5個(gè)具有代表性的HSCs表型標(biāo)志在這些患者肝癌組織中的表達(dá)水平，包括α-SMA、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、結(jié)蛋白(Desmin)、粘著斑蛋白(Vinculin)和波形蛋白(Vimentin);及其和HBV相關(guān)的HCC患者術(shù)

8、后腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及腫瘤侵襲能力的聯(lián)系;接著，利用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)了體外HCC條件培養(yǎng)基(TCM)對(duì)HSCs細(xì)胞株LX-2的表型變化的影響（GFAP、纖維連接蛋白、CD56和白介素17受體）;最后，我們分別從正常/癌旁肝組織和癌組織中分離出HSCs和癌相關(guān)性肌成纖維細(xì)胞(CAMFs)，進(jìn)行全基因表達(dá)譜分析。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1) Desmin和GFAP在肝細(xì)胞癌患者的肝組織中均呈陰性表達(dá);Vinculin和Vimentin則廣泛表達(dá)在

9、癌旁和癌內(nèi)組織的間質(zhì)和實(shí)質(zhì)細(xì)胞中;α-SMA在癌內(nèi)和癌旁組織中均只在間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，陽性染色細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈梭型或星型。(2)癌旁α-SMA陽性HSCs的表達(dá)水平與腫瘤大小(P=0.015)、腫瘤分化(P=0.002)和TNM分期(P=0.028)正相關(guān);單因素和多因素Cox生存分析均證實(shí)，癌旁α-SMA陽性HSCs與HBV相關(guān)性HCC患者的至復(fù)發(fā)時(shí)間(TTR，time torecurrence)和總生存時(shí)間(OS，overall s

10、urvival)相關(guān)，尤其是對(duì)早期復(fù)發(fā)和AFP正常的HCC患者具有預(yù)測(cè)價(jià)值（P均＜0.05）;癌旁和癌內(nèi)的Desmin、GFAP、Vinculin和Vimentin以及癌內(nèi)α-SMA表達(dá)水平與HCC的預(yù)后無顯著相關(guān)性（OS和TTR的P＞0.05）。(3)經(jīng)3種HCC細(xì)胞株（MHCC97L、HCCLM3和HCCLM6）的條件培養(yǎng)基(TCM)刺激后，GFAP+ HSCs細(xì)胞株LX-2比例顯著降低(P＜0.05)，而其他表型標(biāo)志(纖維連接蛋白

11、、CD56和IL-17R)無明顯變化。(4)基因表達(dá)譜結(jié)果分析，與靜止型HSCs比較，癌旁HSCs和癌內(nèi)CAMFs均有大量基因發(fā)生顯著上調(diào)和下調(diào)(P＜0.05)，這些調(diào)節(jié)基因多與生物學(xué)過程、細(xì)胞組成和分子功能有關(guān)，并涉及纖維化、炎癥和癌癥發(fā)展有關(guān)的信號(hào)通路;最后通過選取的一些基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，驗(yàn)證了該基因芯片的可靠性。
　　以上結(jié)果表明，HSCs是構(gòu)成免疫微環(huán)境中不可或缺的一種炎癥細(xì)胞，在炎癥反應(yīng)和腫瘤微環(huán)境中，其表型和功能

12、基因多變，導(dǎo)致其從靜止?fàn)顟B(tài)向活化狀態(tài)，直至肌成纖維樣細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)變，進(jìn)而與各種免疫活性細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞相互作用，發(fā)揮其促瘤作用。癌旁活化的HSCs越多，患者預(yù)后越差，也說明HSCs在肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)中的重要作用。通過綜合評(píng)價(jià)HSCs的基因表達(dá)，數(shù)目、分布等，可以準(zhǔn)確把握肝癌局部免疫狀態(tài)，也提示其作為有用的HCC風(fēng)險(xiǎn)性生物指標(biāo)和肝癌免疫靶向治療的潛在價(jià)值。
　　第二部分TREM-1在肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)及與肝細(xì)胞癌的預(yù)后關(guān)系研究
　　

13、本研究旨在通過HSCs中表達(dá)的炎癥因子TREM-1的研究（通過基因表達(dá)譜篩選，見第一部分），探討炎癥細(xì)胞與腫瘤預(yù)后之間聯(lián)系，并以此為基礎(chǔ)研究腫瘤免疫微環(huán)境中，炎癥細(xì)胞通過釋放各種炎癥信號(hào)，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，進(jìn)而動(dòng)態(tài)調(diào)控促炎反應(yīng)向促瘤方向轉(zhuǎn)化的機(jī)制。
　　本研究中，我們通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)分別檢測(cè)了HSCs被LPS或HCC細(xì)胞株條件培養(yǎng)基刺激后細(xì)胞上清中可溶性TREM-1(sTREM-1)的表達(dá)水平，以及總共92例惡性

14、和/或良性肝腫瘤/肝病血漿中可溶性sTREM-1的表達(dá)水平;借助免疫組織化學(xué)和細(xì)胞定量，評(píng)估TREM-1在總共240例HCC患者（包括檢測(cè)組和驗(yàn)證組）肝切除組織構(gòu)建的組織微陣列中的表達(dá)情況，通過生存分析，研究了TREM-1陽性細(xì)胞的分布、數(shù)目與腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的關(guān)系。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1) TREM-1在大多數(shù)癌內(nèi)和癌旁組織均為陽性表達(dá)，且在癌細(xì)胞和肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。免疫熒光和細(xì)胞化學(xué)也證實(shí)其在活化的HSCs和CAMFs中高表達(dá)。

15、(2)活化HSCs與HCC細(xì)胞株或正常肝細(xì)胞株共培養(yǎng)后，細(xì)胞上清液中sTREM-1、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平顯著增加(P＜0.001);LPS刺激30分鐘以后（10μ g/ml-1ng/ml），從HSCs/CAMFs培養(yǎng)上清檢測(cè)到增加的sTREM-1水平，活化HSCs/CAMFs分泌sTREM-1的峰值在1-2小時(shí)，LPS以時(shí)間依賴性的方式，而非劑量依賴性誘導(dǎo)了sTREM-1從活化HSCs/CMAFs中的分泌;(3) TREM-1

16、激動(dòng)劑/抑制劑誘導(dǎo)HSCs/CAMFs活化后收集的條件培養(yǎng)基，明顯改變了HCC的遷移能力;(4)與良性肝腫瘤比較，HCC患者血清中的sTREM-1、IL-6和TNF-α表達(dá)水平顯著增加(P＜0.005);(5)在檢測(cè)組中，癌旁TREM-1的密度與血管侵襲(P＜0.001)、腫瘤大小(P=0.001)和TNM分期晚期(P＜0.001)顯著相關(guān);單因素分析顯示癌旁高密度的α-SMA和TREM-1與較短的OS（P均＜0.001）和TTR（P均

17、＜0.001）顯著相關(guān);多因素分析進(jìn)一步證明，增加的癌旁α-SMA和TREM-1能夠預(yù)測(cè)患者的OS(P=0.009和0.008)和增加的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)（P=0.015和0.005）。癌旁TREM-1高表達(dá)水平更易與早期復(fù)發(fā)聯(lián)系在一起（單因素P＜0.001和多因素P=0.006），而不是晚期復(fù)發(fā)。驗(yàn)證組獲得了與檢測(cè)組一致的結(jié)果，即癌旁高密度的TREM-1與較短的OS(P＜0.001)和TTR(P=0.002)緊密聯(lián)系在一起。
　　以上結(jié)果

18、提示，以HSCs為例的間質(zhì)細(xì)胞在免疫微環(huán)境和肝癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)中具有重要的作用。通過它們所表達(dá)的一些炎癥信號(hào)或通路的作用，發(fā)生級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，擴(kuò)大微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)，從而進(jìn)一步強(qiáng)化了腫瘤的惡性生物學(xué)行為，促進(jìn)了癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。TREM-1作為其中的一個(gè)炎癥信號(hào)，參與了與腫瘤的侵襲行為，可以作為一個(gè)潛在的HCC預(yù)后預(yù)測(cè)因素以及抗腫瘤治療中的潛在抗炎靶點(diǎn)。
　　第三部分IL-17/IL-17RE與肝星狀細(xì)胞及肝細(xì)胞癌預(yù)后的關(guān)系研究

19、>　　本研究旨在通過研究不同炎癥間質(zhì)細(xì)胞之間（HSCs和Th17）的相互作用，初步探討在腫瘤微環(huán)境中，炎癥信號(hào)作為不同炎癥細(xì)胞之間“交流”的媒介，并協(xié)同作用，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的可能性，為進(jìn)一步深入進(jìn)行各種炎癥細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。
　　通過第一部分中HSCs的基因表達(dá)譜，我們證實(shí)了幾個(gè)IL-17受體（如，IL-17RA、RB和RE）在HSCs中的表達(dá)，因而我們選擇了IL-17受體作為研究對(duì)象。本研究中，我們通過300例

20、HCC術(shù)后切除的組織標(biāo)本，構(gòu)建了組織微陣列，利用免疫組織化學(xué)和細(xì)胞定量的方法，檢測(cè)了IL-17和IL-17R(A-E)家族成員的表達(dá)情況，并評(píng)價(jià)了它們對(duì)HCC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)能力;通過ELISA，檢測(cè)了111例HCC患者血清中6個(gè)Th17相關(guān)性細(xì)胞因子（IL-6、-9、-17、-22、-17R和TNF-α）的表達(dá)水平;用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HSCs條件培養(yǎng)基對(duì)IL-17+ CD4+T細(xì)胞體外增殖的影響。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1) IL-17受

21、體家族成員在各種肝細(xì)胞和癌細(xì)胞中呈局灶性、分散性和彌漫性表達(dá)，顯示出不同的染色模式:IL-17RA和IL-17RB非常相似，在肝組織中的表達(dá)呈彌漫性分布;IL-17RC的表達(dá)在癌內(nèi)和癌旁組織均較弱;除了肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，IL-17RD和IL-17RE均以相似的染色模式表達(dá)在間質(zhì)細(xì)胞;(2)癌旁IL-17RE的密度與血管侵襲(P=0.004)和TNM分期的晚期(P=0.012)相關(guān)，沒有臨床病理指標(biāo)與癌內(nèi)的IL-17RE和IL-17有關(guān)。癌旁和

22、癌內(nèi)IL-17RE的密度均與TTR和OS顯著相關(guān)（P均＜0.001）。癌內(nèi)的IL-17密度是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)測(cè)因素。ROC分析表明癌內(nèi)IL-17RE和IL-17密度組合對(duì)于HCC患者的臨床預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值較單獨(dú)指標(biāo)，更具準(zhǔn)確性。二者密度的組合能夠預(yù)測(cè)早期復(fù)發(fā)和晚期復(fù)發(fā);(3)在HCC患者血清中，IL-6、-22、-17R和TNF-α表達(dá)水平較肝血管瘤患者明顯增加(P＜0.001)，術(shù)后5天，所有這些指標(biāo)的表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.001);

23、(4)利用癌旁活化HSCs的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后，HCC患者和肝血管瘤患者外周血中的IL-17+CD4+和IL17+ CD3+T細(xì)胞的比例顯著增加了(P＜0.01)。未刺激的IL-17+ CD4+和IL17+ CD3+T細(xì)胞比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　以上結(jié)果表明，腫瘤微環(huán)境中，各種炎癥細(xì)胞之間可能存在相互“交流”，它們分泌或表達(dá)的細(xì)胞因子或受體為它們構(gòu)建了聯(lián)系的橋梁。不同類型炎癥細(xì)胞之間的協(xié)同作用，可能改變了腫瘤微環(huán)境的

24、穩(wěn)態(tài)，動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)了腫瘤的發(fā)展方向。如同本研究中的IL-17和IL-17RE，是肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)過程中的重要組成部分，也為我們提供了有用的監(jiān)測(cè)高危患者的指標(biāo)和干預(yù)靶點(diǎn)進(jìn)行靶向治療。
　　結(jié)論
　　1基因表達(dá)譜分析結(jié)果顯示，與靜止型HSCs比較，癌旁HSCs和癌內(nèi)CAMFs均有大量基因發(fā)生顯著上調(diào)和下調(diào)，這些調(diào)節(jié)基因多與生物過程、細(xì)胞組成和分子功能有關(guān)，并涉及纖維化、炎癥和癌癥發(fā)展有關(guān)的信號(hào)通路;
　　2癌旁α-SMA陽性HSC

25、s與HBV相關(guān)性HCC患者的TTR和OS相關(guān)，尤其是對(duì)早期復(fù)發(fā)和AFP正常的HCC患者具有預(yù)測(cè)價(jià)值;
　　3 TREM-1在癌細(xì)胞、肝細(xì)胞和HSCs中表達(dá)，癌旁TREM-1的表達(dá)水平能夠預(yù)測(cè)患者的TTR和OS，其高表達(dá)水平更易與早期復(fù)發(fā)聯(lián)系在一起，而不是晚期復(fù)發(fā)。
　　4癌旁和癌內(nèi)IL-17RE的密度均與TTR和OS顯著正相關(guān)。癌內(nèi)IL-17的密度也是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)測(cè)因素。癌內(nèi)IL-17RE和IL-17的密度組合對(duì)于HCC患者

26、的臨床預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值較單獨(dú)指標(biāo)，更具準(zhǔn)確性。
　　創(chuàng)新點(diǎn)
　　1首次分析和報(bào)道了HCC中癌旁活化的HSCs和癌內(nèi)CAMFs的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)大量變化的功能基因，通過對(duì)這些基因的研究可以準(zhǔn)確把握肝癌局部免疫狀態(tài)，也提示其作為有用的HCC風(fēng)險(xiǎn)性生物指標(biāo)和肝癌多項(xiàng)靶點(diǎn)治療的潛在價(jià)值。
　　2首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了TREM-1不僅表達(dá)在髓樣細(xì)胞中，也表達(dá)在肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞和HSCs中，癌旁TREM-1的表達(dá)水平可以作為HCC術(shù)后切除

27、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的獨(dú)立指標(biāo)，顯示了其作為一個(gè)HCC預(yù)后預(yù)測(cè)因素以及抗腫瘤治療中的抗炎靶點(diǎn)的潛在價(jià)值。
　　3首次證實(shí)癌旁和癌內(nèi)的IL-17RE在HCC術(shù)后患者中的預(yù)測(cè)能力，并證實(shí)了炎癥/免疫細(xì)胞之間相互作用促進(jìn)增殖。
　　潛在應(yīng)用價(jià)值
　　1肝癌腫瘤微環(huán)境中的多種炎癥/免疫細(xì)胞（如HSCs和Th17）的密度與患者術(shù)后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)緊密相關(guān)，可以用于作為監(jiān)測(cè)HCC風(fēng)險(xiǎn)的生物指標(biāo)和肝癌靶向治療的靶點(diǎn)。
　　2從肝癌腫瘤微環(huán)境中炎