巨大肝細(xì)胞癌根治術(shù)后近期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的臨床與相關(guān)蛋白組學(xué)初步研究.pdf

1、目的:
　　應(yīng)用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量蛋白組學(xué)技術(shù)(iTRAQ)鑒定和篩選與巨大肝細(xì)胞癌根治術(shù)后近期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異蛋白,試圖找到術(shù)后近期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)新指標(biāo)和治療新靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.回顧性分析166例巨大肝細(xì)胞癌患者的臨床病理資料,根據(jù)術(shù)后近期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移時(shí)間,分為術(shù)后6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組和6~12個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組,應(yīng)用Logistic回歸模型分不同時(shí)間段對(duì)臨床病理因素進(jìn)行單因素和多因素分析,并建立術(shù)后近期復(fù)發(fā)

2、轉(zhuǎn)移概率預(yù)測(cè)數(shù)學(xué)模型。
　　2.蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn):應(yīng)用巨大肝細(xì)胞癌手術(shù)切除組織標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,根據(jù)臨床隨訪復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與否分為3組(隨訪時(shí)間24個(gè)月):術(shù)后6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組(n=20),術(shù)后6~12個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組(n=20)及未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組;對(duì)這些組織標(biāo)本進(jìn)行蛋白提取、定量和酶解,應(yīng)用iTRAQ試劑標(biāo)記(117標(biāo)記6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組,119標(biāo)記6~12個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組,121標(biāo)記未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組)二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(2DLC-MS/M

3、S)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析。利用Protein Pilot軟件(版本4.2)對(duì)MS/MS肽段進(jìn)行分析,在Intemational Swissprot(20111015,human)數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定蛋白質(zhì)并定量。鑒定蛋白的比值117:121或119:121大于2倍或小于0.5倍(P<0.05)認(rèn)為二者之間存在表達(dá)差異。應(yīng)用MetaCore(GeneGo公司)軟件對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO分析,包括亞細(xì)胞定位、分子功能和生物學(xué)過(guò)程。應(yīng)用IPA(Ingen

4、uity Pathway Analysis)軟件分析差異表達(dá)蛋白參與的信號(hào)通路和蛋白間相互作用的網(wǎng)絡(luò)。
　　3.應(yīng)用蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)部分的組織標(biāo)本和分組標(biāo)準(zhǔn),采用免疫印跡(Western Blot)、免疫組化和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-PCR)技術(shù)從蛋白和mRNA水平檢測(cè)差異蛋白Galectin-4、S100A12和Alpha-methylacyl-CoA racemase(AMACR)表達(dá)情況,驗(yàn)證質(zhì)譜的準(zhǔn)確性。
　　4.采用構(gòu)

5、建組織芯片結(jié)合免疫組化方法檢測(cè)感興趣的目標(biāo)蛋白Galectin-4在73例巨大肝癌術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與73例未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的癌組織及配對(duì)的癌旁組織和10例正常肝組織中的表達(dá)情況,并探討Galectin-4蛋白表達(dá)與各臨床病理參數(shù)及與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.術(shù)后6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為36.7％(61/166),術(shù)后6~12個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為27.1%(45/166);Logistic單因素分析提示術(shù)前血清AFP值≥12

6、10ng/ml(X4)、腫瘤包膜(X7)、鏡下脈管癌栓(X10)、術(shù)后癌細(xì)胞病理分級(jí)(X11)與術(shù)后6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān),術(shù)前血清AFP值≥1210ng/ml(X4)和鏡下脈管癌栓(X10)與術(shù)后6~12個(gè)月復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān);多因素分析提示,術(shù)后6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素為術(shù)前血清AFP值≥1210ng/ml(X4)、腫瘤有包膜(X7)和鏡下脈管癌栓(X10);術(shù)后6~12個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素為術(shù)前血清AFP值≥1210ng/m

7、l(X4)和鏡下脈管癌栓(X10);術(shù)后6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移概率的預(yù)測(cè)方程為P=Y/(1+Y),Y=EXP(-0.852+0.753X4-1.273X7+2.524X10);術(shù)后6~12個(gè)月復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移概率的預(yù)測(cè)方程為P=Y/(1+Y),Y=EXP(-0.804-0.897X4+0.923X10)。
　　2.利用Protein Pilot軟件(版本4.2)對(duì)MS/MS肽段進(jìn)行分析,并在Intemational Swissprot(2011

8、1015,human)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索,共鑒定出1407種蛋白;基于篩選差異表達(dá)蛋白的條件,共篩選出了87個(gè)差異表達(dá)蛋白;與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組比較,6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組差異表達(dá)蛋白有46個(gè),其中15個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào),31個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào),6~12月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組差異表達(dá)蛋白有49個(gè),其中33個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào),16個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào);6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組、6~12月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組共同的差異表達(dá)蛋白有8個(gè),分別是 Galectin-4、Lactotransferrin

9、、Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B、Biliverdin reductase A、60 kDa SS-A/Ro ribonucleoprotein、Apolipoprotein A-II、Protein S100A12和Alpha-methylacyl-CoA racemase(AMACR)。
　　3.87個(gè)差異表達(dá)蛋白生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)大部分定位細(xì)胞質(zhì),分

10、子功能主要是蛋白結(jié)合,生物學(xué)過(guò)程主要體現(xiàn)在代謝和調(diào)控。差異蛋白富集度最高的生物通路是EIF2信號(hào)通路,發(fā)現(xiàn)差異蛋白富集度最高的蛋白網(wǎng)絡(luò)是以ERK1/2為核心的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),共有14個(gè)差異表達(dá)蛋白參與。
　　4.部分差異表達(dá)蛋白驗(yàn)證結(jié)果顯示,與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移癌組織比較,Galectin-4蛋白和相應(yīng)的mRNA表達(dá)在6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移癌組織、6~12月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移癌組織中均下調(diào),與蛋白組學(xué)結(jié)果一致;S100A12和AMACR蛋白與相應(yīng)的mRNA表

11、達(dá)在6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組表達(dá)下調(diào),6~12月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組表達(dá)上調(diào),與蛋白組學(xué)結(jié)果一致。
　　5.Galectin-4 mRNA的表達(dá)在巨大肝癌組織中表達(dá)上調(diào),在癌旁和正常肝組織中表達(dá)均下調(diào),各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);擴(kuò)大臨床組織樣本量采用組織芯片結(jié)合免疫組化的方法檢測(cè)Galectin-4在巨大肝癌中表達(dá)情況,結(jié)果顯示Galectin-4在巨大肝癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為39.0%(57/146),明顯低于癌旁組織71.9%

12、(105/146)和正常肝組織80%(8/10),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05);Galectin-4在12個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性表達(dá)率為19.1%(14/73),明顯低于未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組58.9%(43/73),兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);Galectin-4蛋白陰性表達(dá)與性別、年齡、有無(wú)合并肝硬化、是否合并乙肝病毒感染、腫瘤包膜、癌細(xì)胞病理分化無(wú)關(guān),而與術(shù)前血清AFP值和鏡下脈管癌栓有關(guān)(P均<0.05);Kapl

13、an-Meier生存曲線分析顯示Galectin-4陰性表達(dá)組3年生存率24.0%低于陽(yáng)性表達(dá)組34.8%(χ2=6.589,P=0.010);Galectin-4陰性表達(dá)組1年無(wú)瘤生存率53.1%明顯低于陽(yáng)性表達(dá)組83.6%(χ2=5.836,P=0.016)。
　　結(jié)論:
　　1.巨大肝細(xì)胞癌術(shù)后12個(gè)月復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高;術(shù)前血清AFP值、腫瘤包膜、微血管侵犯是巨大肝細(xì)胞癌根治術(shù)后近期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。
　　2.巨大

14、肝細(xì)胞癌術(shù)后6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和6~12月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響因素不同,復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移概率預(yù)測(cè)的數(shù)學(xué)模型不同。
　　3.經(jīng)驗(yàn)證確認(rèn)的差異表達(dá)蛋白Galectin-4、S100A12、AMACR有望成為巨大肝細(xì)胞癌術(shù)后近期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移潛在的預(yù)警蛋白,其分子機(jī)制需進(jìn)一步研究。
　　4.Galectin-4蛋白在巨大肝癌組織中表達(dá)下調(diào);Galectin-4表達(dá)與術(shù)后近期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān),Galectin-4低表達(dá)提示3年生存率和1年無(wú)瘤生存率低,可為