神經(jīng)肽Y引起人肝細(xì)胞調(diào)亡機(jī)制的比較蛋白組學(xué)研究.pdf

1、神經(jīng)肽Y(NeuropeptideY，NPY)是一種由36個(gè)氨基酸組成，結(jié)構(gòu)類似于鳥(niǎo)胰多肽(avianpancreaticpolypeptide，APP)及多肽YY(peptideYY)的一種神經(jīng)遞質(zhì)，其豐富地表達(dá)于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)。當(dāng)交感神經(jīng)激活時(shí)，NPY可與去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)共同被交感神經(jīng)末梢所釋放。NPY通過(guò)六種不同的G蛋白偶聯(lián)受體在體內(nèi)發(fā)揮著廣泛的作用。在中樞，NPY可影響學(xué)習(xí)、記憶、攝食等功能

2、；而在外周，它對(duì)循環(huán)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)均產(chǎn)生影響。
　　 肝臟是人體最大的腺體，是新陳代謝的重要器官。肝臟被大量的傳入神經(jīng)和傳出神經(jīng)(交感和副交感神經(jīng))所支配。研究表明，在人類肝臟中，NPY能神經(jīng)元是人體肝臟中最為豐富的肽能神經(jīng)元。NPY能神經(jīng)元大量分布于肝動(dòng)脈、門靜脈以及膽道周圍，并且直接貫穿于肝小葉，與肝細(xì)胞直接接觸，從而形成一個(gè)復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。有研究報(bào)道交感神經(jīng)能夠通過(guò)末梢釋放NPY和NE調(diào)節(jié)肝血管的血液量，而NPY

3、對(duì)肝細(xì)胞的作用卻鮮有報(bào)道。
　　 基于納升級(jí)二維液相－串聯(lián)質(zhì)譜(2D-nano－LC－MS/MS)的鳥(niǎo)槍法蛋白組學(xué)研究技術(shù)是指將目標(biāo)蛋白組進(jìn)行酶解形成混合肽段后，采用納升級(jí)二維液相色譜對(duì)肽段混合物進(jìn)行分離，接著通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜逐一檢測(cè)特征性肽段，所得數(shù)據(jù)運(yùn)用SEQUEST等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，從而高通量、高靈敏度和高精度地對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。
　　 為研究NPY對(duì)肝細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制，我們以人肝細(xì)胞L-02為研究對(duì)象，進(jìn)行了

4、以下工作：
　　 1、采用MTT法測(cè)定不同濃度的NPY對(duì)人肝細(xì)胞L-02活力的影響。
　　 2、應(yīng)用Westernblot檢測(cè)NPY刺激人肝細(xì)胞L-02后凋亡標(biāo)志性蛋白的變化。
　　 3、應(yīng)用基于納升級(jí)二維液相－串聯(lián)質(zhì)譜的鳥(niǎo)槍法蛋白組學(xué)技術(shù)研究人肝細(xì)胞L-02在經(jīng)過(guò)NPY刺激后，其蛋白表達(dá)譜的變化，從中挖掘NPY引起人肝細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路。
　　 4、應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析蛋白組數(shù)據(jù)，同時(shí)查閱文獻(xiàn)，篩選與

5、凋亡密切相關(guān)的蛋白。發(fā)掘NPY引起人肝細(xì)胞凋亡的可能信號(hào)通路，并應(yīng)用Westernblot對(duì)部分蛋白的表達(dá)變化進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 5、應(yīng)用mTOR的抑制劑雷帕霉素，進(jìn)一步觀察mTOR信號(hào)通路在NPY引起人肝細(xì)胞凋亡中的作用。
　　 主要工作結(jié)果如下：
　　 1、NPY可呈劑量依賴性明顯降低人肝細(xì)胞L-02的活力，且1nMNPY即具有顯著作用。
　　 2、NPY可導(dǎo)致L-02細(xì)胞凋亡標(biāo)志性蛋白表達(dá)發(fā)生明顯變化

6、，L-02細(xì)胞在經(jīng)過(guò)NPY的刺激后，其剪切caspase-3表達(dá)上調(diào)，Bcl-2家族中Bax、Bad表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)。結(jié)果顯示，NPY可引起L-02細(xì)胞的凋亡。
　　 3、應(yīng)用基于納升級(jí)二維液相-串聯(lián)質(zhì)譜的鳥(niǎo)槍法蛋白組學(xué)研究技術(shù)，10nM的NPY刺激L-02細(xì)胞后，有317個(gè)蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)差異，其中80個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，237個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。經(jīng)過(guò)查閱篩選，與凋亡密切相關(guān)的蛋白有12個(gè)，我們關(guān)注其中的4個(gè)蛋白，即哺乳動(dòng)物

7、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，細(xì)胞色素c(cytochromec)，核糖體蛋白S6激酶(S6K)和熱休克蛋白70(Hsp70)。mTOR可通過(guò)激活S6K而磷酸化BAD，Hsp70可通過(guò)JNK來(lái)調(diào)節(jié)cytochromec的釋放，而cytochromec則能夠活化caspase-9從而剪切caspase-3，引起細(xì)胞的凋亡。
　　 4、經(jīng)Westernblot的進(jìn)一步驗(yàn)證，mTOR、cytochromec、S6K和Hsp70的表達(dá)與納

8、升級(jí)二維液相-串聯(lián)質(zhì)譜所檢測(cè)的表達(dá)模式一致，mTOR、S6K、cytochromec表達(dá)上調(diào)，Hsp70表達(dá)下調(diào)。
　　 5、應(yīng)用mTOR的抑制劑雷帕霉素后，NPY引起L-02細(xì)胞的凋亡被逆轉(zhuǎn)。
　　 綜上所述，NPY可呈劑量依賴地促進(jìn)人肝細(xì)胞的凋亡。10nMNPY刺激L-02細(xì)胞24h后，12個(gè)與凋亡相關(guān)的蛋白發(fā)生變化，其中4個(gè)具有密切的聯(lián)系，我們進(jìn)一步推測(cè)mTOR/S6K/BAD、Hsp70/cytochromec/