人肝臟相關(guān)ConA和DSA結(jié)合型糖蛋白組學(xué)研究.pdf

1、第一部分：人健康肝刀豆凝集素(COn A)結(jié)合型糖蛋白組學(xué)研究 目的：隨著蛋白組學(xué)研究領(lǐng)域的急劇擴(kuò)展，糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)與功能的研究是當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展后的重要延伸領(lǐng)域。在此我們選用可以識(shí)別二天線型和高甘露糖型結(jié)構(gòu)的刀豆凝集素Con A通過(guò)固相親和層析的富集糖蛋白，通過(guò)雙向電泳、質(zhì)譜技術(shù)來(lái)建立相對(duì)穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)的高通量糖蛋白質(zhì)組學(xué)共性技術(shù)平臺(tái)，建立和分析人健康肝組織刀豆凝集素Con A結(jié)合型糖基化蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，為后續(xù)工作奠定了基礎(chǔ)。

2、 方法：從人健康肝組織中提取總蛋白，通過(guò)刀豆凝集素(Con A)親和柱層析分離和濃集Con A結(jié)合型蛋白質(zhì)，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和雙向電泳(2-DE)分離，建立人健康肝組織Con A結(jié)合型蛋白表達(dá)譜，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS/MS)和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定該圖譜中所有蛋白點(diǎn)。利用NetNGlyc和NetOGlyc軟件對(duì)鑒定的蛋白進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，應(yīng)用生物信息學(xué)對(duì)這些蛋白進(jìn)行Qui

3、ckGO搜索，依據(jù)三個(gè)主要的GeneOntology種類(lèi)，即生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞內(nèi)定位對(duì)它們分類(lèi)分析。 結(jié)果：人健康肝組織中提取的總蛋白通過(guò)Con A親和層析柱分離為兩組份，柱不結(jié)合組分由非Con A結(jié)合型糖基化蛋白構(gòu)成；柱結(jié)合組份由Con A結(jié)合型糖基化蛋白組成。兩組份與總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)通過(guò)親和層析使得ConA結(jié)合的低豐度糖蛋白得到富集，在60KD處有一明顯濃集的條帶。對(duì)它們進(jìn)行2-DE分離，并結(jié)合SYPR

4、O-Ruby熒光染色技術(shù)，獲得人健康肝組織Con A結(jié)合型蛋白表達(dá)譜，PDQuest7.0軟件探測(cè)到蛋白質(zhì)點(diǎn)301±15個(gè)，分析圖譜發(fā)現(xiàn)較偏酸性端和堿性端， PI 3-5，MW 25-47KD區(qū)域處有多個(gè)高豐度蛋白，低分子量糖蛋白亦較多；切取130個(gè)蛋白點(diǎn)，應(yīng)用MALDI-TOF-MS/MS進(jìn)行鑒定，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索及去冗余后，共鑒定85種蛋白。將這些蛋白進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，除5個(gè)蛋白僅具有O-連接糖基化位點(diǎn)外，其他蛋白均含有潛在N-連

5、接糖基化位點(diǎn)。應(yīng)用生物信息學(xué)對(duì)這些蛋白進(jìn)行分類(lèi)，發(fā)現(xiàn)參與代謝通路及與細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白分別占35％和22％，Con A結(jié)合型總糖蛋白以定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中為最多。 結(jié)論：(1)凝集素層析、2-DE聯(lián)合MALDI-TOF-MS/MS分析是相對(duì)穩(wěn)定的高通量糖蛋白質(zhì)組學(xué)共性技術(shù)平臺(tái)，可用于大量樣本的疾病蛋白質(zhì)組學(xué)中蛋白質(zhì)糖基化修飾譜的研究，對(duì)發(fā)現(xiàn)與疾病發(fā)生、發(fā)展中相關(guān)的異常糖基化蛋白質(zhì)有重要價(jià)值。(2)本研究建立了人健康肝組織Con

6、 A結(jié)合型蛋白蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。 第二部分： 目的：本部分我們利用已建立的凝集素親和層析技術(shù)平臺(tái)富集DSA結(jié)合型糖蛋白，通過(guò)雙向電泳和多維色譜兩種途徑進(jìn)行分離，利用質(zhì)譜鑒定獲得的糖蛋白數(shù)據(jù)來(lái)建立人健康肝組織及肝癌組織DSA結(jié)合型糖基化蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，為正常狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)糖蛋白的全面闡述提供基本生物學(xué)信息，為蛋白質(zhì)多天線型糖鏈結(jié)構(gòu)在體內(nèi)功能研究提供理論依據(jù)。 方法：通過(guò)免疫熒光檢測(cè)DSA結(jié)合型糖蛋白在人正常肝細(xì)胞chang

7、’s liver中的表達(dá)和定位，從人健康肝組織及肝癌組織中提取總蛋白，通過(guò)蔓陀蘿凝集素(DSA)親和柱層析分離和濃集DSA結(jié)合型糖基化蛋白質(zhì)，分別通過(guò)雙向電泳、糖蛋白染色復(fù)合總蛋白染色、基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS/MS)技術(shù)及通過(guò)二維色譜(2D-LC)、納升級(jí)電噴霧質(zhì)譜(nESI-MS)技術(shù)對(duì)于親和層析所獲得的DSA結(jié)合型糖蛋白進(jìn)一步的分離和鑒定，建立人健康肝組織及肝癌組織DSA結(jié)合型糖基化蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，并

8、對(duì)2-DE和2D-LC兩種分離方法進(jìn)行比較。利用NetNGlyc軟件對(duì)鑒定的蛋白進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，應(yīng)用生物信息學(xué)對(duì)這些蛋白進(jìn)行QuickGO搜索并分類(lèi)分析。 結(jié)果：免疫熒光發(fā)現(xiàn)DSA結(jié)合型糖蛋白定位于細(xì)胞膜、胞質(zhì)及胞核內(nèi)。通過(guò)10％N-乙酰葡萄糖胺寡聚體(Chintin)成功的從人健康肝組織及肝癌組織中總蛋白中分離并富集了DSA結(jié)合型糖蛋白，層析得率為4％。比較研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織和正常肝組織呈現(xiàn)不同的SDS-PAGE和DSA凝

9、集素親和層析圖譜，2-DE電泳結(jié)合糖蛋白染色獲得人健康肝組織DSA結(jié)合型糖基化蛋白表達(dá)譜，ImageMaster軟件探測(cè)到蛋白質(zhì)點(diǎn)60±3個(gè)，分析圖譜發(fā)現(xiàn)DSA結(jié)合型糖蛋白較偏酸性端，PI 4-7，MW 35-85 KD區(qū)域處有許多高豐度蛋白；切取糖蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定，去冗余共鑒定出43種糖蛋白；通過(guò)2D-LC結(jié)合ESI-MS鑒定出人健康肝組織93種蛋白，其中有25種與2DE-MALDI-MS鑒定蛋白相同，且鑒定的分子量范圍較后者為廣，但

10、仍以偏酸性端的蛋白為多。此外ESI-MS鑒定出肝癌組織DSA結(jié)合型糖蛋白98種，與相同條件下鑒定的人健康肝組織蛋白有73種完全匹配，不匹配的點(diǎn)為45種。將這些蛋白進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，并應(yīng)用生物信息學(xué)對(duì)這些蛋白進(jìn)行分類(lèi)，發(fā)現(xiàn)它們大部分都具有潛在的N-糖基化位點(diǎn)，在胞漿、胞膜及胞核中均有不同程度的分布，參與體內(nèi)代謝和細(xì)胞粘附及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過(guò)程。與Con A結(jié)合型糖蛋白相比較，定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)指導(dǎo)蛋白質(zhì)折疊的分子伴侶類(lèi)蛋白質(zhì)較多。 結(jié)論：(1

11、)親和層析、2-DE、MP技術(shù)、MALDI-TOF-MS/MS四者結(jié)合及親和層析-二維色譜-電噴霧質(zhì)譜分析是相對(duì)穩(wěn)定的高通量、糖蛋白質(zhì)組學(xué)共性技術(shù)平臺(tái)。二維色譜可用于小樣本的蛋白質(zhì)糖基化修飾譜研究。(2) 本研究建立了人健康肝及肝癌組織DSA結(jié)合型糖基化蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，用兩種方法共鑒定出人健康肝組織DSA結(jié)合型糖蛋白118種，通過(guò)2D-LC-ESI-MS共鑒定人肝癌組織DSA結(jié)合型糖蛋白98種。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)DSA結(jié)合型的多天線結(jié)構(gòu)的糖

12、蛋白對(duì)于細(xì)胞的識(shí)別黏附、蛋白質(zhì)的折疊轉(zhuǎn)運(yùn)等方面有著非常熏要的作用。 第三部分 人肝癌相關(guān)DSA結(jié)合型比較糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究 目的：通過(guò)差異熒光凝膠電泳(DIGE)技術(shù)比較研究健康肝和人肝癌細(xì)胞組織中DSA．結(jié)合型糖基化蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改變，篩查在肝癌發(fā)生中起重要作用的關(guān)鍵DSA結(jié)合型糖基化蛋白質(zhì)分子，驗(yàn)證其表達(dá)水平及推斷糖鏈結(jié)構(gòu)改變，為肝癌癌變機(jī)制性研究奠定理論基礎(chǔ)。為疾病相關(guān)分子的糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供技術(shù)手段。

13、 方法：從人健康肝組織及肝癌組織中提取總蛋白，通過(guò)蔓陀蘿凝集素(DSA)親和柱層析分離和濃集DSA結(jié)合型糖基化蛋白質(zhì)，分別以cy3和cy5熒光標(biāo)記，以cy2做內(nèi)標(biāo)，通過(guò)差異熒光凝膠電泳技術(shù)在同一塊膠上進(jìn)行分離，利用熒光掃描儀473、532、635三個(gè)通道進(jìn)行掃描獲得的糖蛋白表達(dá)譜圖像經(jīng)Decyder 2D 6.5軟件凝膠圖像分析軟件進(jìn)行點(diǎn)識(shí)別、背景消除、點(diǎn)匹配及差異蛋白質(zhì)分析，后續(xù)跑膠進(jìn)行糖蛋白染色并挖點(diǎn)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒

14、定。結(jié)合第二部分利用2D-LC．ESI-MS鑒定出的差異蛋白按照功能及參與通路進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并對(duì)一種差異蛋白波形蛋白Vimentin異常DSA糖基化進(jìn)行再驗(yàn)證；應(yīng)用免疫印跡分析其蛋白表達(dá)情況；應(yīng)用免疫沉淀結(jié)合多種凝集素親和印跡檢測(cè)這些蛋白與肝癌發(fā)生相關(guān)的其他糖鏈結(jié)構(gòu)改變。 結(jié)果：雙向電泳結(jié)束后，473、532、635三個(gè)通道進(jìn)行掃描獲得的內(nèi)標(biāo)圖譜、人健康肝組織DSA結(jié)合型糖蛋白表達(dá)譜、肝癌組織DSA結(jié)合型糖蛋白表達(dá)譜用分析

15、軟件(DeCyder 2D 6．5)進(jìn)行批量分析，人健康肝組織中被檢測(cè)到的蛋白質(zhì)點(diǎn)308±15個(gè)，肝癌組織中檢測(cè)到的有353±26個(gè)點(diǎn)。其中相匹配(所有圖譜共有的)有266個(gè)，不能相匹配的檢測(cè)點(diǎn)有41個(gè)，被認(rèn)為是雜質(zhì)微粒或者由實(shí)驗(yàn)所帶來(lái)的隨機(jī)誤差。差異大于1.4倍以上的蛋白點(diǎn)有30個(gè)，經(jīng)質(zhì)譜鑒定出的差異蛋白點(diǎn)有26個(gè)，16個(gè)是在腫瘤中上調(diào)。綜合前面通過(guò)2D-LC鑒定出的差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在差異蛋白中以定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基

16、體中具有分子伴侶功能，并指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊及翻譯后修飾或與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的蛋白為最多。選擇Vimentin進(jìn)行異常DSA結(jié)合型糖基化再驗(yàn)證，它們?cè)诟伟┙M織提取的DSA結(jié)合型糖基化蛋白中表達(dá)水平較正常肝組織要高。凝集素親和印跡法對(duì)Vimentin進(jìn)行糖鏈結(jié)構(gòu)推斷，發(fā)現(xiàn)Vimentin對(duì)Con A、DSA、LCA都具有親和力。且在肝癌組織中對(duì)DSA和Con A的親和力要增強(qiáng)。 結(jié)論：(1)凝集素親和層析結(jié)合DIGE技術(shù)聯(lián)合MALD