神經(jīng)肽P物質活化NK92-MI細胞的蛋白質組學及相關機制研究.pdf

1、神經(jīng)-內分泌-免疫網(wǎng)絡在維持機體內環(huán)境及生理功能平衡和穩(wěn)定過程中具有重要作用。神經(jīng)遞質、神經(jīng)肽、激素等可通過與免疫細胞上相應的受體結合發(fā)揮免疫調節(jié)功能。神經(jīng)肽P物質(SP)是發(fā)現(xiàn)最早的神經(jīng)肽之一，廣泛分布于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)及組織器官。SP不僅是一種重要的神經(jīng)遞質，而且還是神經(jīng)系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)共同的調節(jié)因子，是傳遞信息、調節(jié)機體反應的重要信使。SP的功能主要通過NK-1R介導，NK-1R在NK細胞、T細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞

2、等均有表達。
　　 NK細胞是天然免疫系統(tǒng)的主要效應細胞，殺傷靶細胞不需抗原預先致敏，無MHC限制性，其功能的發(fā)揮主要依賴于其識別靶細胞的受體。NK細胞能通過早期分泌多種細胞因子和趨化因子來調節(jié)獲得性免疫，是連接天然免疫與獲得性免疫的橋梁。
　　 目前，有關SP對NK細胞生物學功能的調控研究，國內外報道較少。已有一些研究（包括本課題組的研究）表明SP對NK細胞有調節(jié)作用，但其作用機制尚不十分清楚，特別是SP活化NK細胞的

3、信號通路未見報道，其活化過程中變化的蛋白分子也報道較少。
　　 蛋白質組學是在整體水平上研究細胞內蛋白質組成及其活動規(guī)律的科學，可對不同時間和空間發(fā)揮功能的特定蛋白質群體進行研究。通過比較分析不同條件下蛋白質組的差異表達，來發(fā)現(xiàn)和鑒定出有差異的蛋白質或蛋白質群。因此，蛋白質組學技術的發(fā)展為全面研究細胞蛋白質變化提供了條件。
　　 NK-1R屬G-蛋白偶聯(lián)受體家族，受體激活后通過G-蛋白調節(jié)第二信使的形成。我們采用Real

4、-time PCR和流式細胞術分別測定了SP對NK-1R基因表達和膜受體表達的影響，結果顯示SP可誘導NK-1R的表達明顯增高，說明SP通過增加NK-1R的表達來放大其對NK92-MI細胞的各種調節(jié)作用，提示SP對NK92-MI細胞的各種調節(jié)作用應為SP激活NK-1R后的下游事件。因此有必要進一步研究SP對與G蛋白影響。
　　 G蛋白屬外周蛋白，它們在膜的細胞質面通過脂肪酸鏈錨定在質膜上。G蛋白由α、β、γ三個亞基組成，Gα亞基

5、在信號傳遞過程中發(fā)揮主導作用。G蛋白是一個大家族，分為Gs，Gi/o，Gq/11和G124個家族。依細胞類型的不同，SP可通過不同的G蛋白產生不同的第二信使而發(fā)揮作用。
　　 根據(jù)對腺苷酸環(huán)化酶(AC)的作用，G蛋白可分為刺激性G蛋白(Gs)和抑制性G蛋白(Gi)。Gs的主要作用是激活AC和鈣離子通道，Gi的主要作用是抑制AC和激活鉀離子通道。細胞內cAMP的產量與AC的活性密切相關，AC被激活后促進cAMP的合成。cAMP作為

6、第二信使激活依賴cAMP的蛋白激酶A(PKA)實現(xiàn)信號傳導功能，參與細胞代謝過程的調節(jié)。cAMP-PKA信號通路是否參與SP活化NK細胞的過程尚無報道。
　　 本研究制備了SP活化的NK92-MI細胞和對照組細胞總蛋白的雙向凝膠圖譜，應用PDQuest軟件對雙向凝膠電泳圖譜進行比較分析，找出差異表達的蛋白質點，再采用MALDI-TOF-MS質譜分析對差異表達的蛋白質進行鑒定，搜索數(shù)據(jù)庫鑒定全部差異表達的蛋白質。擬獲得SP激活NK

7、92-MI細胞前后的差異表達蛋白譜。
　　 通過QRT-PCR和westernblot技術分別檢測SP對NK92-MI細胞Gαs和Gαi3mRNA和蛋白表達的影響。采用Gs特異性拮抗劑NF449分析Gs在SP調節(jié)NK92-MI細胞功能中的作用。通過檢測NF449對SP活化NK92-MI細胞活性及相關分子的影響來探討SP調控NK92-MI細胞的信號傳導途徑，從而闡明SP調控NK細胞功能的分子機制。
　　 材料和方法：

8、>　　 1.細胞培養(yǎng)
　　 NK細胞株:NK92-MI細胞株用含12.5％胎牛血清和12.5％馬血清的α-MEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。
　　 2.SP活化NK細胞的蛋白質組學分析
　　 制備了SP活化的NK92-MI細胞和對照組細胞總蛋白的雙向凝膠圖譜，應用PDQuest軟件對雙向凝膠電泳圖譜進行比較分析，找出差異表達的蛋白質點，再采用MALDI-TOF-MS質譜分析對差異表達的蛋白質進行鑒定，搜索數(shù)據(jù)庫鑒定全部差異

9、表達的蛋白質。
　　 3.SP對NK92-MI細胞Gαs和Gαi3表達的影響
　　 通過QRT-PCR和western blot技術分別檢測SP對NK92-MI細胞Gαs和Gαi3mRNA和蛋白表達的影響。
　　 4.NF449對SP活化的NK92-MI細胞殺傷活性、增殖活性的影響
　　 NF449預處理組NK92-MI細胞用Gs拮抗劑NF449預先作用30min，無NF449預處理組用相同體積PBS作用

10、，再以濃度為10-12 M的SP作用24h（殺傷試驗）或48h（增殖試驗），用CCK-8試劑盒檢測NF449對SP活化的NK細胞殺傷活性和增殖活性的影響。
　　 5.NF449對SP活化的NK92-MI細胞與殺傷活性相關的蛋白和基因表達的影響NF449預處理組NK92-MI細胞用Gs拮抗劑NF449預先作用30min，無NF449預處理組用相同體積PBS作用，再以濃度為10-12M的SP作用24h。提取細胞總蛋白和RNA，分別用

11、Real-Time PCR和Western-Blot技術檢測NF449對SP活化的NK92-MI細胞穿孔素和顆粒酶B mRNA和蛋白表達的影響;用Real-Time PCR檢測NF449對SP活化的NK92-MI細胞IFN-γ mRNA表達的影響;分別用Real-Time PCR和流式細胞技術檢測NF449對SP活化的NK92-MI細胞NKp46、NKp44、NKp30 mRNA及膜受體的表達的影響。
　　 6.統(tǒng)計學分析

12、>　　 所得實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（x±SD）表示，各組間均數(shù)比較采用一維方差分析(one-way ANOVA)，p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.通過雙向電泳結合質譜技術和生物信息學手段分析了SP活化的NK92-MI細胞和對照組細胞的蛋白質差異，共找出40個差異蛋白點，鑒定出Rho GDI等21種蛋白質。通過GO進行功能分類，這些蛋白具有抗凋亡、參與免疫應答、參與應激反應、細胞周期、調節(jié)細胞

13、生長和參與信號傳導等功能。
　　 2.濃度為10-12、10-10M的SP均可促進NK92-MI細胞Gαs和Gαi3 mRNA表達，與對照組比較有明顯差異。濃度為10-14、10-12、10-10M的SP均可促進NK92-MI細胞Gαs蛋白表達，與對照組比較有明顯差異;濃度為10-12、10-10M的SP對Gαi3的表達有促進作用，與對照組比較有明顯差異。
　　 3.結果顯示濃度為10-12M的SP能夠促進無NF449預

14、處理組細胞殺傷活性，但對NF449預處理組細胞則無明顯促進殺傷活性作用。且在此濃度SP作用下，無NF449預處理組細胞殺傷活性明顯高于NF449預處理組細胞。這表明NF449對SP的促殺傷活性具有阻斷作用。
　　 4.濃度為10-12M的SP對無NF449預處理組和NF449預處理組細胞均有促進增殖活性作用;在此濃度的SP作用下，兩組細胞的增殖活性無明顯差異。結果表明，NF449對SP的促增殖活性無明顯影響。
　　 5.

15、濃度為10-12M的SP能夠明顯促進NK92-MI細胞穿孔素和顆粒酶mRNA和蛋白表達水平，但NF449對這種促進作用有明顯的阻斷作用。進而表明SP可通過促進Gs的表達促進穿孔素和顆粒酶的表達，從而促進NK92-MI細胞的殺傷活性。
　　 6.濃度為10-12M的SP對無NF449預處理組NK92-MI細胞IFN-γ mRNA的表達有促進作用，但對NF449預處理組NK92-MI細胞IFN-γ mRNA的表達無明顯促進作用。結果

16、表明SP可通過促進Gs的表達上調IFN-γ mRNA的表達，這也可能與SP促進NK92-MI細胞的殺傷活性有關。
　　 7.濃度為10-12 M的SP對無NF449預處理組和NF449預處理組NK92-MI細胞NKp44、NKp30 mRNA的表達均有促進作用。流式細胞檢測結果顯示濃度為10-12M的SP對無NF449預處理組NK92-MI細胞NKp44的表達有促進作用，但對NF449預處理組NK92-MI細胞無明顯促進作用，在

17、此濃度的SP作用下，無NF449預處理組細胞NKp44的表達水平明顯高于NF449頇處理組細胞;濃度為10-12M的SP對無NF449預處理組和NF449預處理組NK92-MI細胞的NKp30表達均無明顯影響。結果表明NF449對SP促進NKp44表達的活性具有一定的阻斷作用，也進一步表明NF449對SP活化NK92-MI細胞殺傷活性的阻斷作用與NF449對NKp44表達的阻斷作用有關。
　　 結論：
　　 1.Rho

18、GDI蛋白可能與SP活化NK92-MI細胞的信號傳導過程有關。
　　 2.SP可促進NK92-MI細胞Gαs和Gαi3 mRNA及蛋白的表達，表明SP對cAMP-PKA通路有調控作用
　　 3.NF449對SP的促殺傷活性具有一定的抑制作用;NF449對SP的促增殖活性無明顯影響。表明SP可通過促進Gs表達促進NK92-MI細胞殺傷活性。
　　 4.NF449對SP促進穿孔素、顆粒酶、NKp44分子表達的活性具有