神經(jīng)肽P物質(zhì)對(duì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)調(diào)控效應(yīng)及相關(guān)經(jīng)典Wnt-β-catenin通路機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、神經(jīng)因素在骨組織再生及重建過程中作用重要，而神經(jīng)肽正是神經(jīng)因素發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的主要物質(zhì)。P物質(zhì)(Substanc P，SP)是廣泛分布于骨髓和骨膜的感覺神經(jīng)元分泌的一種神經(jīng)肽，其生物化學(xué)結(jié)構(gòu)由11種氨基酸構(gòu)成，參與調(diào)控骨組織細(xì)胞如骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。不少體內(nèi)和體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，SP可以通過促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)增殖能力增強(qiáng)、成骨基因表達(dá)及礦化來促進(jìn)骨形成過程，調(diào)控骨折愈合生理過程。
　　神經(jīng)肽SP的

2、調(diào)控作用通常需要通過相關(guān)受體實(shí)現(xiàn)，SP受體主要是神經(jīng)激肽-1受體(NK-1受體)，此受體可介導(dǎo)SP促進(jìn)骨形成的生物學(xué)效應(yīng)過程。已有研究證實(shí)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)NK-1受體的mRNA，且表達(dá)部位位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜內(nèi)，提示SP相關(guān)調(diào)控作用的可行性。NK-1受體可介導(dǎo)某些抗凋亡反應(yīng)，如NK-1受體拮抗劑可誘導(dǎo)人類癌細(xì)胞株(Hep-2)凋亡。因此NK1-1受體表達(dá)及SP調(diào)控凋亡機(jī)制的相關(guān)性可能是神經(jīng)肽P

3、物質(zhì)調(diào)控骨折愈合生理過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的調(diào)控離不開細(xì)胞信號(hào)通路。已有研究證實(shí)經(jīng)典Wnt/β-catenin通路和MAPK信號(hào)通路等多種細(xì)胞信號(hào)通路參與了P物質(zhì)調(diào)控BMSCs增殖和礦化，但Wnt信號(hào)通路是否參與SP抗骨髓基質(zhì)干細(xì)胞去血清誘導(dǎo)凋亡尚未證實(shí)。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路是骨代謝生理的關(guān)鍵通路因素。經(jīng)典Wnt通路可以概括為β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)增加，積累到一定程度時(shí)可進(jìn)

4、入核內(nèi)引起下游Wnt相關(guān)基因如c-myc等轉(zhuǎn)錄表達(dá)。研究表明，SP調(diào)控骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖效應(yīng)、促進(jìn)BMSCs和前成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)分化程度均與經(jīng)典Wnt通路有關(guān)，而Wnt信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡通路也具有相關(guān)性。因此SP的抗凋亡作用是否由經(jīng)典Wnt信號(hào)通路介導(dǎo)有必要進(jìn)行研究。
　　以上研究背景提示目前存在三個(gè)問題，即:P物質(zhì)是否能夠調(diào)控骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的去血清誘導(dǎo)凋亡過程？其調(diào)控效應(yīng)具有何種濃度及時(shí)間特點(diǎn)？其調(diào)控機(jī)制涉及何種凋亡

5、信號(hào)通路及Wnt信號(hào)通路改變？這些問題的解釋將進(jìn)一步加深目前對(duì)神經(jīng)因素通過神經(jīng)肽調(diào)控骨折愈合過程的分子機(jī)制的研究，以及骨折修復(fù)過程中的神經(jīng)保護(hù)作用的理解。
　　本研究主要是研究神經(jīng)肽P物質(zhì)對(duì)大鼠BMSCs去血清誘導(dǎo)凋亡的調(diào)控效應(yīng)、凋亡蛋白3等凋亡信號(hào)改變及相關(guān)經(jīng)典Wnt/β-catenin通路機(jī)制，同時(shí)探討NK-1受體表達(dá)水平在細(xì)胞凋亡過程中的變化情況。本實(shí)驗(yàn)主要的實(shí)驗(yàn)材料、方法、內(nèi)容和結(jié)論主要包括以下幾個(gè)部分:
　　研究目

6、的:1.神經(jīng)肽P物質(zhì)對(duì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞去血清凋亡的影響。
　　2.神經(jīng)肽P物質(zhì)作用下去血清誘導(dǎo)凋亡的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的凋亡通路相關(guān)信號(hào)改變情況。
　　3.神經(jīng)肽P物質(zhì)調(diào)控骨髓基質(zhì)干細(xì)胞凋亡與經(jīng)典Wnt/β-catenin通路的關(guān)系。
　　第1部分大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的獲取鑒定及NK-1受體檢測(cè)
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過全骨髓培養(yǎng)法獲取純度較高的大鼠BMSCs，并通過流式鑒定其純度，同時(shí)研究其NK-1受體表達(dá)。

7、　　實(shí)驗(yàn)方法:1.大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞獲取
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇年齡一個(gè)月左右重量80-100g大小的SD大鼠，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求直接脫頸法處死，于清潔條件無菌器械輔助下，按層次切開大鼠解剖結(jié)構(gòu)后獲取大鼠的股骨及脛骨。使用針頭沖洗骨髓腔，加入DMEM培養(yǎng)基（含10％胎牛血清）行全骨髓法分離培養(yǎng)BMSCs。
　　2.大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)
　　原代培養(yǎng)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞48-72h后，首次換液后及時(shí)清洗培養(yǎng)瓶，去除未貼壁細(xì)

8、胞后傳代培養(yǎng)，按照1∶2或1∶3的接種比例經(jīng)胰酶消化后傳代至培養(yǎng)瓶中，采用含胎牛血清(10％)及青霉素鏈霉素溶液(1％)的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)液體每2-3天進(jìn)行換液，細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿瓶底后傳三代，胰酶消化后按1∶2傳代，通過光鏡及倒置顯微鏡觀察大鼠BMSCs形態(tài)變化特點(diǎn)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:通過全骨髓培養(yǎng)法于體外成功分離培養(yǎng)出可用于實(shí)驗(yàn)的較高純度大鼠BMSCs。流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果顯示FL1-Height(0.2％±1.7％)、

9、CD90(99.7％±3.1％)、IgG1（0.96％±1.3％）、CD34（1.06％±1.3％）、CD44(99.8％±4.1％)、CD45(1.7％±2.1％)、IgG2a(0.35％±2.9％)、CD11b/C(0.6％±1.7％)、HAMSTER(0.09％±0.7％)、CD29(99.88％±3.1％)，符合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型特征。同時(shí)，NK-1受體表達(dá)于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，其蛋白表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定。
　

10、　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:全骨髓培養(yǎng)法可獲得大量純度較高的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，且其表面穩(wěn)定表達(dá)NK-1受體，為下一步研究提供了種子細(xì)胞和理論基礎(chǔ)。
　　第2部分P物質(zhì)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞去血清誘導(dǎo)下細(xì)胞活性的影響
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?初步觀察P物質(zhì)作用于去血清誘導(dǎo)下的BMSCs后的細(xì)胞活性變化。
　　實(shí)驗(yàn)方法:1.實(shí)驗(yàn)分組處理
　　取三代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，分為四組，即對(duì)照組（加入等量PBS做安慰劑）、SP(10-8 mol/L)組、SP

11、(10-10 mol/L)組、SP(10-12 mol/L)組，接種于96孔板內(nèi)于去學(xué)期誘導(dǎo)凋亡后12小時(shí)和24小時(shí)分別采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。初步篩選出適宜濃度和適宜時(shí)間點(diǎn)后，使用DAPI熒光染色法和Annexin V-FITC/PI染色，熒光顯微鏡觀察和上機(jī)（流式細(xì)胞儀）檢測(cè)細(xì)胞凋亡率改變。
　　2.MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性
　　96孔板內(nèi)每孔加入15μl的MTT溶液（1∶10稀釋），于37℃環(huán)境下孵育4h后，每孔加入15

12、0μ1的DMSO用于溶解產(chǎn)生的晶體，隨后利用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(495 nm波長(zhǎng)讀數(shù))。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:MTT結(jié)果顯示24h去血清處理后，10-10 mol/L SP實(shí)驗(yàn)處理能夠提高細(xì)胞活性，進(jìn)一步的DAPI熒光染色顯示SP能夠保護(hù)細(xì)胞核形態(tài)皺縮形變等改變，且減少細(xì)胞凋亡率(AnnexinV熒光標(biāo)記法)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:P物質(zhì)能夠提高骨髓基質(zhì)干細(xì)胞于去血清處理后的細(xì)胞活性，改善細(xì)胞核形態(tài)變化且減少細(xì)胞凋亡率。
　　第3部

13、分P物質(zhì)對(duì)骨髓間充質(zhì)于細(xì)胞去血清誘導(dǎo)凋亡影響及相關(guān)凋亡通路調(diào)控機(jī)制的初步探討
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?初步探討P物質(zhì)調(diào)控骨髓基質(zhì)干細(xì)胞凋亡過程中的細(xì)胞凋亡通路信號(hào)改變。
　　實(shí)驗(yàn)方法:1.實(shí)驗(yàn)分組處理
　　首先將第三代大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞隨機(jī)分為四組，即對(duì)照組、SP(10-8 mol/L)組、SP(10-10 mol/L)組、SP(10-12 mol/L)組，測(cè)定凋亡蛋白3表達(dá)，探討P物質(zhì)抗凋亡效應(yīng)的濃度特異性。進(jìn)一步設(shè)置對(duì)照組、

14、SP(10-10 mol/L)組、SP(10-10 mol/L)+NK-1受體拮抗劑(Spantide10-8 mol/L)組，探討SP抗凋亡效應(yīng)機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:P物質(zhì)作用于去血清的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞后，凋亡蛋白3熒光染色陽性細(xì)胞數(shù)量減少，相關(guān)RNA和蛋白表達(dá)減少，以10-10 mol/L最為明顯。凋亡基因改變顯示P物質(zhì)在12小時(shí)和24小時(shí)可減少凋亡信號(hào)Bax/Bcl-2比例，調(diào)控caspase-8、caspase-9和casp

15、ase-3凋亡基因改變。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:P物質(zhì)可調(diào)控骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的內(nèi)源性凋亡通路信號(hào)，減少凋亡蛋白3表達(dá)，從而抑制細(xì)胞去血清凋亡過程。
　　第4部分P物質(zhì)調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞去血清誘導(dǎo)凋亡的相關(guān)經(jīng)典Wnt/β-catenin通路機(jī)制的探討
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?初步探討P物質(zhì)調(diào)控骨髓基質(zhì)干細(xì)胞凋亡的經(jīng)典Wnt通路信號(hào)相關(guān)機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法:1.實(shí)驗(yàn)分組處理
　　首先設(shè)置對(duì)照組、SP(10-10mol/L)組、S

16、P(10-10mol/L)+Wnt通路拮抗劑DKK（0.01g/L）組、SP(10-10mol/L)+NK-1受體拮抗劑(Spantide10-8mol/L)組，測(cè)定Wnt通路和凋亡通路基因蛋白改變，并再次設(shè)置對(duì)照組、SP(10-8mol/L)組、SP（10-10mol/L）組、SP(10-12mol/L)組確認(rèn)Wnt通路蛋白相關(guān)改變情況。
　　2.Western blot、Q-PCR檢測(cè)Wnt通路和凋亡通路基因、蛋白表達(dá)

17、　　提取實(shí)驗(yàn)組總RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，熒光定量測(cè)定Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-8、 caspase-9、β-catenin、GSK-3β、c-myc和cyclin D1含量。相關(guān)結(jié)果于12小時(shí)和24小時(shí)分別測(cè)定三次。
　　3.免疫細(xì)胞熒光法檢測(cè)β-catenin蛋白定位
　　取三代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理后，固定液處理15分鐘后，使用0.4％Triton溶液破膜10分鐘，脫脂牛奶封閉抗體30分鐘，之后以

18、1∶300稀釋的β-catenin一抗PBST溶液孵育過夜。PBS沖洗三次后，以FITC綠色熒光二抗室溫下避光孵育30分鐘，吸出液體后再次已DAPI染色15分鐘，熒光顯微鏡下觀察。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:P物質(zhì)作用于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，促進(jìn)經(jīng)典Wnt通路β-catenin、p-GSK-3β、c-myc和cyclin D1基因和蛋白表達(dá)增高以及β-catenin轉(zhuǎn)移入核，阻斷Wnt通路后P物質(zhì)抗凋亡效應(yīng)減弱且Wnt通路表現(xiàn)水平減低。