骨髓基質(zhì)干細胞的生物學特性及對膠質(zhì)瘤的趨向效應的實驗研究.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤疾病中膠質(zhì)瘤的發(fā)病率最高，約占40～50％。盡管臨床的綜合治療方案能產(chǎn)生一些療效，但膠質(zhì)瘤的預后仍然很差?；蛑委煹某霈F(xiàn)為我們展示了良好的前景。但由于病毒載體自身毒性、目的基因表達周期短、靶向性問題、免疫源性或者不能選擇到合適的追蹤浸潤瘤細胞載體等原因，在I期和Ⅱ期臨床試驗都未能取得預期的療效。骨髓基質(zhì)干細胞作為一種新型的載體出現(xiàn)引起了科學工作者的關(guān)注，它培養(yǎng)方法簡單成熟，具有多向分化潛能和定向遷移能力，而且外源性基因表達穩(wěn)

2、定，來源安全可靠，沒有倫理學困擾，因此能夠選作為種子細胞進行靶向治療。骨髓基質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)鑒定分化等生物學特性研究是各項干細胞實驗的基礎(chǔ)，也是研究的熱點和難點。在體內(nèi)干細胞向神經(jīng)元方向分化的比例相當?shù)?。這就需要給予合適的誘導策略增加其神經(jīng)方向的分化率。堿性成纖維細胞生長因子的誘導血管生成，促進有絲分裂等生物學作用較顯著。體內(nèi)研究中由于外源性因子的導入困難，而應激條件下被激活的內(nèi)源性堿性成纖維細胞生長因子表達有限，所以骨髓基質(zhì)干細胞分

3、化為神經(jīng)細胞修復整合受傷的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的功能有限，因此將相關(guān)基因?qū)牍撬杌|(zhì)干細胞使其能夠持續(xù)穩(wěn)定的表達有助于神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療。骨髓基質(zhì)干細胞能夠選擇性趨向體內(nèi)各損傷部位，他的這種歸巢性被認為是其發(fā)揮腫瘤治療作用的重要基礎(chǔ)。而且骨髓基質(zhì)干細胞能夠通過多種機制治療腦腫瘤。骨髓基質(zhì)干細胞體外所處環(huán)境與體內(nèi)微環(huán)境不同，目前在體外模擬體內(nèi)環(huán)境條件下干細胞對膠質(zhì)瘤細胞趨向效應的研究較少。考慮到未來臨床使用的可操作性問題，應該選擇經(jīng)何種途徑移植干細胞

4、治療膠質(zhì)瘤才能達到最大效果。在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展的病理過程中常有一些相關(guān)特異性因子參與，這些因子的表達變化可以作為膠質(zhì)瘤治療效果的評估指標。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-3被認為是腦惡性腫瘤糖代謝的第一個限速因子，缺氧誘導因子-1α是惡性腫瘤參與腫瘤血管生成、腫瘤細胞代謝、凋亡的重要核轉(zhuǎn)錄因子。目前對這幾種因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中的共同表達研究甚少。基于此，我們進行以下研究。
　　第一部分骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學特性研究
　　目的：研究骨

5、髓間充質(zhì)干細胞的生物學特性。方法：對BMSCs進行體外分離培養(yǎng)誘導分化,并免疫組化，流式細胞術(shù)，免疫熒光鑒定。構(gòu)建bFGF過表達載體并測序，慢病毒包裝后轉(zhuǎn)染BMSCs,分別在體外體內(nèi)通過形態(tài)學，免疫組化，免疫熒光，westernblot，PCR，觀察bFGF基因修飾后的骨髓基質(zhì)干細胞增殖、分化及遷移效應的情況。結(jié)果：BMSCs分離接種24h后，可見細胞貼壁，3d以后，進入細胞對數(shù)生長期。1W左右，可觀察到細胞逐漸增多并形成突起相互聯(lián)系，

6、生長速度減慢。培養(yǎng)12d后，細胞達到融合成片鋪滿瓶底。實驗組細胞數(shù)量與未經(jīng)誘導組相比有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；免疫細胞化學方法檢測發(fā)現(xiàn)CD44，CD29，CD90,CD105染色的細胞胞漿呈現(xiàn)棕黃色。CD44陽性細胞率為92.0±3.2％，CD29陽性細胞率為94.6±4.8％,而CD45，CD11b,CD34染色的細胞胞內(nèi)幾乎沒有表達；流式細胞術(shù)檢測細胞表面標記可見CD90為99.64％，CD34為1.23％，CD44為99.

7、54％，CD11b為0.43％；BMSCs經(jīng)誘導分化3d后表達Nestin抗原，7d后細胞表現(xiàn)出典型的神經(jīng)元樣改變，檢測到來源于BMSCS的部分細胞可分別表達NeuN和GFAP。NSE、NeuN、GFAP免疫反應陽性細胞的比例在培養(yǎng)的早期隨時間延長而逐漸增多。但到1W后，比例逐漸降低。經(jīng)誘導的組別的NeuN陽性細胞明顯多于對照組（P＜0.05）。載體構(gòu)建和病毒包裝實驗中，篩選酶切后得到pUC57-SL08重組質(zhì)粒酶切后的SL08片段。將

8、SL08片段克隆入pLenti6/V5-D-TOPO得到pLenti6-SL08重組質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進行測序，鑒定成功構(gòu)建bFGF的過表達載體，慢病毒滴度定量測得為3×107v.p./ml。pLenti6-SL08轉(zhuǎn)染大鼠骨髓基質(zhì)干細胞48h后，通過Westernblot與RT-PCR檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組均有bFGF基因的表達，bFGF基因修飾的BMSCs組中bFGF表達效果最明顯。體外培養(yǎng)實驗中，基因轉(zhuǎn)染后BMSCs各組細胞24小時后細胞數(shù)

9、量開始增加，48至72小時后，細胞數(shù)量均顯著增多，pLenti6-SL08組細胞數(shù)量多于其他兩組，但各組間數(shù)量無顯著差異(P＞0.05)，7天左右均可見有明顯神經(jīng)元樣改變細胞出現(xiàn)，此時三組細胞數(shù)量增長均顯著放緩，但是pLenti6-SL08組細胞數(shù)量顯著多于其他兩組(P＜0.05)，其他兩組間細胞數(shù)無明顯差異(P＞0.05)。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，pLenti6-SL08組CD9096.44％，CD340.61％，BMSCs-2組CD44

10、99.95％，CD11b0.73％。細胞體外培養(yǎng)到一周后，3組細胞均見大部分細胞出現(xiàn)明顯神經(jīng)元樣改變。pLenti6-SL08組神經(jīng)元樣改變細胞數(shù)量與其他兩組比有顯著差異(P＜0.05)。pLenti6-SL08載體轉(zhuǎn)染大鼠骨髓基質(zhì)干細胞48h后，通過Westernblot與RT-PCR檢測bFGF表達，證明經(jīng)bFGF修飾的骨髓基質(zhì)干細胞組的bFGF基因表達明顯強于其他兩組，轉(zhuǎn)染結(jié)果可靠。培養(yǎng)7天后免疫細胞組織化學方法發(fā)現(xiàn)三組細胞中均可

11、見Nestin,NeuN,GFAP的表達。pLenti6-SL08組細胞的Nestin,NeuN表達顯著多于其他兩組(P＜0.05)。Westernblot檢測pLenti6-SL08組Nestin,NeuN均顯著高于其他兩組(P＜0.05)，而其他兩組間Nestin,NeuN的表達無明顯差異(P＞0.05)。腦創(chuàng)傷體內(nèi)模型中，免疫組織化學結(jié)果顯示：各時間點損傷側(cè)BrdU陽性細胞多于對側(cè)(P<0.001)，而且經(jīng)bFGF修飾BMSCs組

12、在各時間點陽性細胞均多于未經(jīng)修飾組(P<0.001)；1W后所檢出的BrdU陽性細胞開始減少，但在損傷同側(cè)部位bFGF修飾BMSCs組降低幅度要小的多(P=0.08)。Westernblot檢測各組腦組織不同時間點bFGF的表達情況發(fā)現(xiàn)實驗組，對照組不同時間點bFGF表達有顯著差異(P＜0.05)。實驗組bFGF7d時明顯增高(P＜0.05)，14d時雖下降但無統(tǒng)計差異(P=0.12)；對照組bFGF7d時明顯增高(P＜0.05)，14

13、d時顯著下降(P＜0.05)；各時間點bFGF在實驗組表達強于對照組(P＜0.05)。免疫熒光雙標實驗中發(fā)現(xiàn)兩組干細胞移植到腦內(nèi)后均可以表達干細胞標記的BrdU,并且同樣能夠分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，但分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞的比例遠大于神經(jīng)元。同側(cè)腦室、皮質(zhì)區(qū)域可見BMSCs組和bFGF修飾BMSCs組均有大量BMSCs分布，兩組間有顯著差異(P＜0.05)；在同側(cè)腦室、皮質(zhì)區(qū)域可見bFGF修飾BMSCs組干細胞分化為神經(jīng)元顯著多于BMS

14、Cs組(P＜0.05)。結(jié)論：骨髓基質(zhì)干細胞體外分離培養(yǎng)可以得到高純度的骨髓基質(zhì)干細胞，bFGF修飾的骨髓基質(zhì)干細胞在體內(nèi)外均能穩(wěn)定持續(xù)地增殖和神經(jīng)細胞方向的分化，而且能更顯著地向腦外傷后的損傷部位遷移。
　　第二部分骨髓基質(zhì)干細胞對膠質(zhì)瘤細胞的趨向效應
　　目的：研究骨髓基質(zhì)干細胞在體外和體內(nèi)向膠質(zhì)瘤細胞的趨向及對膠質(zhì)瘤細胞的抑制效應。方法：通過免疫組化，Westernblot評估GLUT-3、HIF-1α是否可作為評估膠

15、質(zhì)瘤生物學行為的指標之一。然后模擬體內(nèi)環(huán)境，采用Transwell、MTT、平板克隆等方法觀察預處理的BMSCs對膠質(zhì)瘤細胞的趨向、抑制等方面效應，然后構(gòu)建大鼠C6膠質(zhì)瘤模型，經(jīng)不同途徑移植BMSCs，通過行為學，形態(tài)學，組織病理學，分子生物學等方法觀察BMSCs對膠質(zhì)瘤細胞的趨向、抑制效應。結(jié)果：免疫組化方法檢測發(fā)現(xiàn)GLUT-3、HIF-1α其表達強度隨膠質(zhì)瘤的病理分級增加而升高(P＜0.001)。westernblot檢測兩者的表達

16、與免疫組化結(jié)果相似。體外實驗部分：我們觀察到C6細胞生長迅速，傳代后細胞增殖速度依然很快。在Transwell共培養(yǎng)體系中預處理和未經(jīng)預處理的BMSCs分別與C6膠質(zhì)瘤細胞共培養(yǎng)，HE染色方法發(fā)現(xiàn)兩組小室內(nèi)膜上均有大量細胞通過，實驗組通過小孔的細胞數(shù)量多于對照組(P<0.001)。MTT結(jié)果顯示用含有普通骨髓基質(zhì)干細胞上清液培養(yǎng)的C6細胞生長增殖速度明顯高于預誘導骨髓基質(zhì)干細胞上清液培養(yǎng)的C6細胞組(P＜0.05)。平板克隆實驗結(jié)果顯示

17、，對照組上清液培養(yǎng)的C6細胞形成的克隆數(shù)多于實驗組(P＜0.05)。這兩組用Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)預處理骨髓基質(zhì)干細胞培養(yǎng)液組GLUT-3和HIF1α表達明顯被抑制(P＜0.05)。體內(nèi)實驗:發(fā)現(xiàn)對照組最早出現(xiàn)顱內(nèi)壓增高癥狀癥狀，且很快加重，BMSC-1組最晚出現(xiàn)以上癥狀。對照組第3天時即開始出現(xiàn)死亡病例，BMSC-1組存活時間最長為45天,各組生存率有顯著差異(P＜0.05)。HE發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細胞十分密集，向正常腦組織浸潤，正常

18、組織區(qū)別明顯，細胞小核大，多見核分裂相，有明顯的癌巢。對照組腫瘤體積最大，經(jīng)腦室組最小(P＜0.05)。BrdU免疫組化染色結(jié)果顯示:骨髓基質(zhì)干細胞在通過側(cè)腦室移植入鼠腦膠質(zhì)瘤模型后，干細胞在腦室周圍，血管和海馬等處分布較明顯，主要集中在膠質(zhì)瘤的邊緣部位或與臨近組織處交接范圍。腫瘤同側(cè)半球中的表達高于腫瘤內(nèi)部表達(P<0.001)。同側(cè)半球分布明顯多于對側(cè)半球分布(P<0.001)。經(jīng)尾靜脈途徑移植組發(fā)現(xiàn)BrdU陽性細胞主要集中在腫瘤所

19、在半球的血管和腫瘤周邊，在腫瘤內(nèi)、腦室附近及對側(cè)半球極少,腫瘤同側(cè)半球中的表達多于腫瘤內(nèi)部表達（P<0.001），同側(cè)半球分布明顯多于對側(cè)半球分布(P<0.001)。兩組相比較，經(jīng)側(cè)腦室移植途徑腫瘤內(nèi)部BrdU陽性細胞多于尾靜脈途徑移植組（P<0.001）在腫瘤同側(cè)半球的陽性細胞也明顯多于尾靜脈途徑移植組(P<0.001)，對側(cè)半球陽性細胞也多于尾靜脈組(P<0.001)。Westernblot檢測顯示在BMSCs-1、BMSCs-2組

20、及對照組中GLUT-3，HIF1α的表達分別成遞增趨勢(P＜0.05)。RT-PCR檢測與Westernblot相似，GLUT-3和HIF1α的表達也均成遞增趨勢(P＜0.05)。結(jié)論：初步證實了GLUT-3和HIF1α是參與膠質(zhì)瘤發(fā)病機制的重要因子，在體外經(jīng)預誘導處理的骨髓間充質(zhì)干細胞對膠質(zhì)瘤細胞的趨向性更強，可抑制腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖，降低GLUT-3和HIF1α的表達，體內(nèi)經(jīng)腦室移植途徑干細胞能更多地向膠質(zhì)瘤遷移，能明顯抑制瘤體增大