神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 由于創(chuàng)傷、感染等各種原因造成的骨折、骨不愈合等一直是威脅人類生命健康的醫(yī)學(xué)難題。對于從根本上提高其治療效果而言,明確骨形成、重建、塑形的病理生理學(xué)特點及其生物學(xué)機(jī)制是其基礎(chǔ)和出發(fā)點。骨組織是一種伴隨著細(xì)胞外基質(zhì)礦化、根據(jù)需要不斷自我修復(fù)的復(fù)雜動態(tài)組織,亦是帶有血管、神經(jīng)支配的生物活性組織,因此,骨折修復(fù)過程中既有機(jī)體多種組織、細(xì)胞因子之間錯綜復(fù)雜的協(xié)同作用,更與血液供應(yīng)、神經(jīng)支配密切相關(guān),其修復(fù)區(qū)域內(nèi)環(huán)境的生物

2、學(xué)穩(wěn)定性尤其是血液供應(yīng)和神經(jīng)支配的重建是關(guān)鍵因素。血液供應(yīng)的重建對于骨及移植物保持生物學(xué)活性的重要性已被眾多實驗及臨床實踐所證實,除此之外,骨組織再生中神經(jīng)因素可能同樣發(fā)揮著重要作用。在早期進(jìn)行的骨發(fā)育學(xué)研究顯示:一些先天顱面發(fā)育缺陷疾病常常伴有神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙的現(xiàn)象提示神經(jīng)系統(tǒng)對骨發(fā)育支配和調(diào)節(jié)的重要性。再者,眾多解剖學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)以及臨床實踐研究均已證實神經(jīng)因素對骨折愈合、骨修復(fù)具有確切的生物調(diào)節(jié)作用。但是目前對神經(jīng)因素調(diào)控骨組織再

3、生的生物學(xué)機(jī)制研究較少。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)植入感覺神經(jīng)能夠促進(jìn)組織工程骨成骨及修復(fù)骨缺損,且骨再生區(qū)域的神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY含量明顯增加,提示我們神經(jīng)肽類物質(zhì)在骨折愈合、重建中可能起到重要作用,可能是神經(jīng)發(fā)揮其調(diào)控作用的關(guān)鍵因素。近年來,神經(jīng)肽類物質(zhì)在骨折愈合、骨組織再生中的重要作用已逐漸得到人們的重視,并成為國內(nèi)、外學(xué)者新的研究熱點之一。神經(jīng)肽是神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的具有神經(jīng)調(diào)節(jié)活性的肽類物質(zhì),具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng),其中,降鈣素基

4、因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)、P物質(zhì)(substance P,SP)、神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y)是最具代表性的物質(zhì)。CGRP和SP是感覺神經(jīng)纖維分泌的兩種主要神經(jīng)肽;NPY是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最高、分布最廣的神經(jīng)肽之一,介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控的重要因子。目前的研究多局限在神經(jīng)肽對成骨細(xì)胞的影響,對成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞——骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow

5、stem cells,BMSCs)的研究較少。BMSCs具有強大的增殖能力和多向分化潛能,在骨代謝中扮演著重要角色,在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下可被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和造血細(xì)胞等多種細(xì)胞,是骨組織工程研究領(lǐng)域的理想種子細(xì)胞。因此,闡明神經(jīng)肽對BMSCs的具體作用有助于我們更好的了解神經(jīng)肽在骨代謝過程中發(fā)揮的作用,進(jìn)一步揭示骨再生過程中的神經(jīng)生物學(xué)作用機(jī)制。本實驗通過BMSCs的體外培養(yǎng),從細(xì)胞學(xué)角度,采用免疫組織化、細(xì)胞

6、遷移、PCR和Western Blot等方法,對神經(jīng)肽及其受體在BMSCs中的表達(dá)與生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行研究,為進(jìn)一步深入研究骨再生、骨代謝過程中的神經(jīng)生物學(xué)調(diào)節(jié)分子轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制奠定堅實基礎(chǔ),同時也可為其在骨折以及骨代謝疾病中的臨床應(yīng)用提供新的思路和實驗依據(jù)。
　　 研究目的
　　 1.明確神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY受體在BMSCs及其成骨分化中的表達(dá)趨勢。
　　 2.明確神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY調(diào)控BMSCs增殖的

7、作用及其機(jī)制。
　　 3.初步探明神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY在BMSCs成骨分化中的生物學(xué)效應(yīng)及機(jī)制。
　　 4.初步探明神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY對BMSCs遷移的作用。
　　 研究方法
　　 1.BMSCs及其成骨分化過程中神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY受體的表達(dá)檢測
　　 采用全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,分別使用流式細(xì)胞儀檢測和免疫細(xì)胞化學(xué)對BMSCs表型標(biāo)志物和成骨分化進(jìn)

8、行鑒定,取第2代BMSCs用于實驗。分為誘導(dǎo)成骨組及未誘導(dǎo)組,在BMSCs傳代(第2代)培養(yǎng)的不同時期(1、2、3w),采用Real TimeRT-PCR、Western Blot檢測細(xì)胞CGRP、SP、NPY受體mRNA及蛋白表達(dá)。
　　 2.神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY對BMSCs增殖的調(diào)控作用及其機(jī)制研究
　　 將活力大于95％的大鼠第2代BMSCs細(xì)胞以104/孔密度種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,細(xì)胞貼壁后換無血清培養(yǎng)基

9、24小時,使細(xì)胞同步化于G0期。后以CGRP(10-8mol/L),SP(10-8mol/L),NPY(50nM)分別刺激1,3,5,7d,采用MTT法測定OD值,繪制細(xì)胞生長曲線；采用RT-PCR、Western Blot檢測細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)。
　　 3.神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY對BMSCs成骨分化的作用及相關(guān)生物學(xué)機(jī)制研究
　　 將CGRP(10-8mol/L),SP(10-8mol/L),NPY(50nM

10、)分別作用于傳代(第3代)培養(yǎng)的BMSCs,常規(guī)培養(yǎng)組作為對照,于不同時間點(1、7、14、21d),應(yīng)用Western Blot比較分析BMSCs中成骨細(xì)胞特征性物質(zhì)(ALP、BGP)合成情況；應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)、Western Blot對細(xì)胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的表達(dá)進(jìn)行檢測分析。
　　 4.神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY對BMSCs遷移的作用及其機(jī)制研究
　　 應(yīng)用Real

11、TimeRT-PCR、Western Blot檢測血管細(xì)胞細(xì)胞粘附分子(VCAM-1)表達(dá),對神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY影響B(tài)MSCs粘附及遷移作用機(jī)制進(jìn)行初步分析；利用細(xì)胞劃痕實驗、趨化實驗對神經(jīng)肽作用BMSCs后的遷移能力進(jìn)行檢測。
　　 5.統(tǒng)計學(xué)方法
　　 計量資料以(x)±s表示,選取檢驗水準(zhǔn)a=0.05,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　 Transwell細(xì)胞趨化實驗數(shù)據(jù)采用多樣本均

12、數(shù)比較的方差分析(One-WayANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,經(jīng)Levene檢驗滿足方差齊性后,組間比較以LSD方法為準(zhǔn),方差不齊的數(shù)據(jù)以近似方法DunnetT3分析結(jié)果為準(zhǔn)。
　　 BMP2、VEGF表達(dá)的Western Blot檢測中同一時間點多個組間的數(shù)據(jù)采用One-Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,經(jīng)Levene檢驗滿足方差齊性后,組間比較以LSD方法為準(zhǔn),方差不齊的數(shù)據(jù)以近似方法DunnetT3分析結(jié)果為準(zhǔn)；同組兩個時間

13、點之間的數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗,并檢驗其方差齊性。
　　 其他實驗數(shù)據(jù)均采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析；當(dāng)資料滿足球形假設(shè)時以Sphericity Assumed方法為準(zhǔn)。當(dāng)資料不滿足球形假設(shè)時需用ε校正系數(shù)來校正自由度。對有顯著意義的主效應(yīng)進(jìn)行多重比較,采用LSD法。對同一時間點多組別的比較采用One-Way ANOVA進(jìn)行分析,同一組不同時間點的數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測量的方差分析,經(jīng)Levene檢驗數(shù)據(jù)滿足方差齊性以LSD方法為

14、準(zhǔn),方差不齊的數(shù)據(jù)以近似方法DunnetT3分析結(jié)果為準(zhǔn)。
　　 結(jié)果
　　 1.BMSCs及其成骨分化過程中神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY受體的表達(dá)檢測
　　 1.1 BMSCs的分離和鑒定
　　 全骨髓培養(yǎng)的第2代BMSCs表面標(biāo)志物鑒定結(jié)果分別為:CD29(96％)、CD44(95.9％),CD45(2.9％)、CD34(2.6％)；免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:成骨細(xì)胞誘導(dǎo)7d后,ALP染色陽性,COLⅠ染

15、色陽性；成骨誘導(dǎo)14d后,BGP染色陽性,COLⅢ染色陰性。Western Blot檢測結(jié)果顯示:各時間點的成骨誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)組相比ALP、BGP、COLⅠ蛋白含量隨誘導(dǎo)時間依次增高,COLⅢ隨誘導(dǎo)時間下降,因此,本實驗獲取的BMSCs具有干細(xì)胞特性,采用適當(dāng)方法可誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化。
　　 1.2 BMSCs成骨分化過程中神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY受體的表達(dá)
　　 CGRP受體的表達(dá):Real Time RT-PC

16、R結(jié)果顯示同一時間點誘導(dǎo)組CGRP受體mRNA表達(dá)量高于未誘導(dǎo)組,誘導(dǎo)組CGRP受體mRNA表達(dá)以時間依賴性的方式不斷增高；Western Blot結(jié)果顯示同一時間點誘導(dǎo)組CGRP受體的蛋白水平高于未誘導(dǎo)組,誘導(dǎo)組CGRP受體蛋白水平以時間依賴性的方式增高。
　　 SP受體的表達(dá):BMSCs及其誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞有SP受體表達(dá)；SP受體mRNA在誘導(dǎo)1周時下降,在誘導(dǎo)至3周時顯著增高；同一時間點誘導(dǎo)組SP受體的蛋白水平高于未誘導(dǎo)組,

17、誘導(dǎo)組SP受體蛋白水平在第3周時顯著增高,呈明顯的時間依賴性。
　　 NPY受體的表達(dá):Real Time RT-PCR結(jié)果顯示同一時間點誘導(dǎo)組Y1受體mRNA表達(dá)量低于未誘導(dǎo)組,誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組Y1受體mRNA表達(dá)均以時間依賴性的方式增高。Western blot結(jié)果顯示同一時間點誘導(dǎo)組Y1受體的蛋白水平高于未誘導(dǎo)組,誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組Y1受體蛋白水平以時間依賴性的方式減少。
　　 2.神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY對BM

18、SCs增殖的調(diào)控作用及其機(jī)制研究
　　 2.1神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY對BMSCs增殖作用
　　 大鼠BMSCs在三種神經(jīng)肽干預(yù)的不同時間點之間OD值均有顯著性差異(F=143.271,P<0.001)。CGRP、NPY組在第1天OD值最小,之后隨培養(yǎng)時間顯著升高,至第9天達(dá)到最大值；SP、對照組在第1天OD值最小,之后隨培養(yǎng)時間顯著升高,至第7天達(dá)到最大值,在第9天時下降;干預(yù)組與干預(yù)時間存在交互效應(yīng)(F=5.21

19、5,P<0.001)。各時間點的神經(jīng)肽組與對照組相比OD值增高顯著,均有顯著差異(P<0.05)。其中,SP組的促大鼠BMSCs增殖效率最高。
　　 2.2細(xì)胞增殖相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)檢測
　　 采用Western Blot技術(shù),檢測CGRP、SP、NPY對BMSCs細(xì)胞周期素cyclinD1、cyclinE,p53基因蛋白表達(dá)的影響。CGRP組中cyclinD1蛋白表達(dá)在第5d時達(dá)到高峰,與對照組比較增高明顯,有統(tǒng)計學(xué)意義

20、(P<0.05)；3、5、7d的SP、NPY組與對照組相比,cyclinD1蛋白表達(dá)減少,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CGRP、SP、NPY組促進(jìn)cyclinE蛋白表達(dá)的作用均在第5d時達(dá)到高峰,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；3、5、7d的CGRP、SP、NPY組p53蛋白表達(dá)與對照組相比減少明顯,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY對BMSCs成骨分化的作用及相關(guān)生物學(xué)機(jī)制研究
　　

21、 3.1成骨細(xì)胞特征性物質(zhì)合成檢測
　　 Western Blot檢測結(jié)果:使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的條件下,采用不同濃度的CGRP、SP、NPY作用于BMSCs,在7、14、21d均明顯促進(jìn)ALP和BGP的蛋白表達(dá)量,同一時間的神經(jīng)肽作用組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.2 BMP2、VEGF表達(dá)檢測
　　 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示:在神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY作用后的5、7d,BMP2

22、、VEGF染色陽性,胞質(zhì)呈棕色。Western Blot結(jié)果顯示:第5天、第7天的三種神經(jīng)肽組與對照組相比,BMP2蛋白表達(dá)增加明顯,四組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(第5天:F=292.722,P<0.001；第7天:F=1670.207,P<0.001)。其中,第七天時,CGRP組、SP組、對照組中BMP2的蛋白表達(dá)高于第5天；第7天時,NPY組中BMP2蛋白表達(dá)低于第5天,均有顯著性差異(P<0.05)。
　　 第5天的三種神經(jīng)肽與

23、對照組相比,VEGF蛋白表達(dá)增加明顯,四組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=429.338,P<0.001)。第7天時,三種神經(jīng)肽組中VEGF蛋白表達(dá)高于第5天,均有顯著性差異(P<0.05)。
　　 4.神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY對BMSCs遷移的作用及其機(jī)制研究
　　 4.1細(xì)胞劃痕實驗觀察結(jié)果:與對照組相比,三種神經(jīng)肽均能不同程度的促進(jìn)BMSCs遷移,其中,以SP組7、9d的作用最強,細(xì)胞遷移的總距離和速度明顯增加。

24、>　　 4.2Transwell細(xì)胞趨化實驗結(jié)果:對照組、CGRP組、SP組、NPY組刺激組細(xì)胞遷移數(shù)分別為(1.11±0.49)、(3.20±1.77)、(4.78±1.77)、(4.86±0.96)個/高倍鏡視野,各神經(jīng)肽作用組與對照組比較細(xì)胞遷移數(shù)目增加,四組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=20.021,P<0.001)。
　　 4.3 VCAM-1的RT-PCR檢測
　　 大鼠BMSCs在CGRP干預(yù)的不同時間點VCA

25、M-1mRNA表達(dá)均有顯著性差異(F=484.012,P<0.001)。CGRP組中VCAM-1mRNA表達(dá)具有時間依賴性,不斷遞增,在第7天時達(dá)到高峰；干預(yù)組與干預(yù)時間存在交互效應(yīng)(F=683.607,P<0.001)。其中,第3天、第5天、第7天的CGRP組與對照組相比VCAM-1mRNA表達(dá)明顯增加,均有顯著性差異(P<0.05)。其他兩種神經(jīng)肽均未能檢測到VCAM-1表達(dá)。
　　 結(jié)論
　　 1.BMSCs表達(dá)C

26、GRP、SP、NPY受體,在成骨分化過程中各種受體的表達(dá)趨勢各異,可能與其在骨重建過程中的不同介導(dǎo)作用有關(guān)。
　　 2.CGRP、SP、NPY對BMSCs的增殖有直接促進(jìn)作用,通過影響cyclinD1、cyclinE、P53等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)是其可能的作用機(jī)制。
　　 3.CGRP、SP、NPY促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化,影響成骨特征性蛋白的表達(dá)是其可能的作用機(jī)制之一。
　　 4.CGRP、SP、NPY在