龜板防治GIOP中miRNA調(diào)控Wnt-β-catenin通路的機(jī)理研究.pdf

1、目的:
　　1.篩查GIOP患者椎體骨組織中差異表達(dá)的miRNA并通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)Wnt/β-catenin通路相關(guān)的靶基因，初步揭示GIOP的發(fā)病機(jī)制;
　　2.明確補(bǔ)腎中藥龜板在體內(nèi)防治GIOP的作用并探討差異miRNA let-7f調(diào)控wnt/β-catenin信號(hào)通路在補(bǔ)腎中藥龜板防治GIOP過程的作用;
　　3.探討補(bǔ)腎中藥龜板有效成分促進(jìn)BMSCs增殖和成骨分化的作用及l(fā)et-7f對(duì)TNFR2的靶向調(diào)

2、控作用。
　　方法:
　　1.臨床研究
　　(1)高通量測(cè)序篩查差異miRNA及其靶基因預(yù)測(cè)
　　選取2014年10月-2015年10月廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱骨科入院需要行脊柱手術(shù)治療的患者6例，其中GIOP患者3例，正常對(duì)照組3例。收集其椎體骨進(jìn)行總RNA提取，高通量測(cè)序篩查椎體骨組織中差異miRNA;生物信息學(xué)對(duì)差異miRNAs進(jìn)行聚類分析，預(yù)測(cè)差異miRNA靶基因，并進(jìn)行GO分析、Pathway分析

3、和新miRNAs預(yù)測(cè)。
　　(2) RT-qPCR驗(yàn)證高通量測(cè)序篩查的差異miRNAs，預(yù)測(cè)Wnt/β-catenin通路相關(guān)的靶基因
　　選取2014年10月-2016年10月廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱骨科收入院需要行脊柱手術(shù)治療的患者20例，其中GIOP10例，正常對(duì)照組10例。RT-qPCR驗(yàn)證高通量測(cè)序篩查的差異miRNAs，生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)驗(yàn)證后差異miRNA靶基因，并預(yù)測(cè)與Wnt/β-catenin通路相關(guān)

4、的靶基因。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
　　(1)龜板對(duì)GIOP大鼠的防治作用
　　200只3月齡SD大鼠隨機(jī)分為兩部分，每部分100只，分別用于預(yù)防實(shí)驗(yàn)和治療實(shí)驗(yàn)的研究。預(yù)防實(shí)驗(yàn)和治療實(shí)驗(yàn)均隨機(jī)分為五個(gè)組，每組20只，兩部分實(shí)驗(yàn)分組均為:對(duì)照組（SHAM組）、模型組（GIOP組）、阿倫磷酸鈉組(ALN組)、龜板組(PT組)，龜板+阿倫磷酸鈉聯(lián)合組（PT+ALN組）。預(yù)防實(shí)驗(yàn)在造模的同時(shí)給予藥物干預(yù)，分別在造?；蚪o藥后1月(

5、M1)、2月(M2)和3月(M3)進(jìn)行取材，檢測(cè)指標(biāo)。治療實(shí)驗(yàn)在造模3個(gè)月后開始給予藥物治療，分別在給藥后的1月(M1)，2月(M2)和3月(M3)進(jìn)行取材，檢測(cè)指標(biāo)。
　?、贉y(cè)量大鼠空腹時(shí)體重，處死后游離大鼠子宮和雙側(cè)腎上腺進(jìn)行分別稱重;
　　②取大鼠L1-3椎體進(jìn)行離體骨密度測(cè)量;
　?、鄯蛛xL2椎體進(jìn)行micro-CT掃描，劃定椎體感興趣區(qū)域，并進(jìn)行三維重建;
　?、躄2椎體micro-CT掃描完畢后，去除

6、其椎體后方附件及上下終板，磨平至兩端平行、約5mm高度的中心圓柱體。萬能材料試驗(yàn)儀器以1mm/min速度進(jìn)行壓縮試驗(yàn);
　?、萑4椎體甲醛固定后，進(jìn)行脫鈣、脫水、包埋、切片處理，HE染色檢測(cè)椎體內(nèi)骨組織形態(tài)學(xué)變化;
　　⑥?、葜星泻玫陌灼M(jìn)行TRAP染色，評(píng)估椎體骨小梁表面破骨分化情況;
　　(2)龜板對(duì)GIOP大鼠血清AKP活性及骨轉(zhuǎn)化指標(biāo)的影響
　　①取上述(1)中實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，離心獲取血清，堿

7、性磷酸酶測(cè)試盒檢測(cè)血清AKP活性;
　?、贓LISA檢測(cè)上述①中血清骨轉(zhuǎn)化指標(biāo)PINP和β-CTX表達(dá)水平;
　　(3)龜板對(duì)大鼠椎體let-7f和Wnt/β-catenin通路相關(guān)因子的調(diào)控作用
　?、偃∩鲜?1)中實(shí)驗(yàn)大鼠L5、L6，去除椎體附件、軟組織和終板軟骨，液氮保存?zhèn)溆谩?br>　?、赗T-qPCR檢測(cè)上述①中L5/6椎體中l(wèi)et-7f、TNFR2、GSK3β、β-catenin、AP-1、CTSK、MMP

8、9、OPG、Runx2、SP7的基因表達(dá);
　?、跧HC檢測(cè)(1)中L4椎體Runx2、CTSK的蛋白表達(dá);
　?、躓estern-blot檢測(cè)上述①中L5/6椎體中TNFR2、p-GSK3β、p-β-catenin、Runx2、CTSK蛋白表達(dá);
　　3.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究
　　(1)龜板有效成分(PTE)對(duì)BMSCs的增殖和成骨分化作用
　　4周齡SD大鼠股骨或脛骨髓腔提取原代BMSCs，培養(yǎng)、傳代。CCK8

9、檢測(cè)不同濃度PTE在1、3、5、7、14、21天的增殖情況;選取最佳濃度進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，ALP染色和茜素紅染色檢測(cè)PTE對(duì)BMSCs成骨分化的影響;
　　(2) let-7f與TNFR2的靶向調(diào)控關(guān)系
　　構(gòu)建TNFR2(TNFRSF1B)點(diǎn)突變載體和TNFR2(TNFRSF1B)3'UTR野生型載體，應(yīng)用LipofectamineTM2000試劑將TNFRSF1B-3' UTR野生型載體、TNFRSF1B-MUT突變載體與N

10、C mimics、let-7f-5p mimics共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)觀察let-7f-5p對(duì)TNFRSF1B的靶向結(jié)合作用。
　　結(jié)果:
　　1.臨床研究
　　(1)高通量測(cè)序篩查差異miRNA及其靶基因預(yù)測(cè)
　　高通量測(cè)序篩選出18個(gè)顯著差異表達(dá)的miRNA，其中2個(gè)表達(dá)上調(diào)，16個(gè)表達(dá)下調(diào)。通過在miranda、mirbase及targetscan數(shù)據(jù)庫中預(yù)測(cè)差異miRNAs靶基因，發(fā)現(xiàn)上

11、調(diào)的miRNAs在數(shù)據(jù)庫中共有靶基因488個(gè)。下調(diào)miRNA在數(shù)據(jù)庫中共有靶基因475個(gè)。此外，還發(fā)現(xiàn)3個(gè)新miRNA，分別在1號(hào)、11號(hào)和12號(hào)染色體上。
　　(2) RT-qPCR驗(yàn)證高通量測(cè)序篩查的差異miRNAs，預(yù)測(cè)Wnt/β-catenin通路相關(guān)的靶基因
　　根據(jù)測(cè)序結(jié)果及原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化tag數(shù)，共選出25個(gè)miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，hsa-miR-186-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-

12、214-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-451a五個(gè)表達(dá)顯著上調(diào)miRNAs和hsa-let-7f-5p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-27a-3p三個(gè)表達(dá)顯著下調(diào)miRNAs，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中l(wèi)et-7f最具顯著性，通過查詢KEGG及文獻(xiàn)，其靶基因TNFR2與Wnt/β-catenin通路密切相關(guān)。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
　　(1)龜板對(duì)GIOP大鼠的防治作用

13、>　?、俑鹘M大鼠體重、子宮和腎上腺質(zhì)量比較
　　預(yù)防實(shí)驗(yàn)中，與SHAM組比較，GIOP組在M1、M2、M3時(shí)體重、子宮和腎上腺質(zhì)量均顯著降低（P＜0.05);與GIOP組比較，PT組和PT+ALN組體重、子宮和腎上腺質(zhì)量在M1、M3時(shí)均顯著升高（P＜0.05);
　　在治療實(shí)驗(yàn)中，與SHAM組比較，GIOP組在M1、M2時(shí)體重及M1時(shí)腎上腺顯著降低（P＜0.01）;與GIOP比較，各治療組腎上腺質(zhì)量在M1時(shí)顯著升高(P＜0.

14、05)。
　?、诟鹘M大鼠腰椎骨密度結(jié)果比較
　　預(yù)防實(shí)驗(yàn)中，與SHAM組比較，GIOP組BMD在M1、M2和M3時(shí)均明顯降低(P＜0.05)，AREA和BMC在M1和M2時(shí)明顯降低(P＜0.05); PT和PT+ALN組在M1、M2、M3時(shí)BMD、BMC或AREA顯著高于GIOP組(P＜0.05)。各治療組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　治療實(shí)驗(yàn)中，GIOP組的BMC和BMD均顯著低于SHAM組（P＜0.05);在M1時(shí)，與GI

15、OP組比較，各治療組AREA和BMC明顯升高(P＜0.05);在M3時(shí)，各治療組BMC和BMD均明顯高于GIOP組(P＜0.05)，PT組和ALN組AREA較GIOP組明顯升高（P＜0.05)。
　?、鄹鹘M大鼠腰椎骨微細(xì)結(jié)構(gòu)比較
　　預(yù)防實(shí)驗(yàn)的M3時(shí)，與SHAM組比較，GIOP組BS/TV、Tb.N、Tb.Th、vBMD均明顯降低(P＜0.05)，GIOP組SMI、Tb.Sp均明顯升高(P＜0.05);與GIOP比較，PT組

16、和PT+ALN組SMI顯著低于GIOP組(P＜0.05)，PT組Tb.Th和PT+ALN組Tb.N顯著高于GIOP組（P＜0.05)。
　　治療實(shí)驗(yàn)的M3時(shí)，與SHAM組比較，GIOP組BV/TV、Tb.Th、vBMD明顯降低(P＜0.05)，SMI、Tb.Sp明顯升高(P＜0.05);與GIOP組比較，各治療組BS/TV、Tb.N、Tb.Th、vBMD均明顯升高(P＜0.05)，SMI、Tb.Sp均降低(P＜0.05)。

17、　　在預(yù)防和治療實(shí)驗(yàn)中，micro-CT二維及三維重建圖均顯示，GIOP組與SHAM組比較骨微細(xì)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，各治療組較GIOP組骨微細(xì)結(jié)構(gòu)明顯改善。
　?、芨鹘M大鼠腰椎骨生物力學(xué)比較
　　預(yù)防實(shí)驗(yàn)的M3時(shí)，與SHAM組比較，GIOP組壓縮強(qiáng)度顯著降低(P＜0.05)。與GIOP組比較，PT組和PT+ALN組壓縮強(qiáng)度和PT組壓縮剛度明顯高于GIOP組(P＜0.05)。
　　治療實(shí)驗(yàn)的M3時(shí)，與SHAM組比較，GIOP組

18、壓縮強(qiáng)度顯著降低(P＜0.05);與GIOP組比較，各治療組壓縮強(qiáng)度和能量吸收值均顯著升高(P＜0.05)。
　?、莞鹘M大鼠腰椎形態(tài)學(xué)改變
　　預(yù)防和治療實(shí)驗(yàn)中，在不同時(shí)間點(diǎn)GIOP組與SHAM組比較，骨小梁有不同程度損害，表現(xiàn)為數(shù)量明顯減少、斷裂，排列紊亂，間隙明顯增寬;骨小梁表面成、破骨細(xì)胞稀疏，骨髓腔干細(xì)胞稀少，骨髓腔脂肪泡明顯增多。PT和PT+ALN組在不同時(shí)間點(diǎn)，骨小梁損害可獲得不同程度改善。
　?、薷鹘M大鼠

19、腰椎破骨活性比較
　　預(yù)防和治療實(shí)驗(yàn)在不同時(shí)間點(diǎn)，與SHAM組比較，TRAP染色陽性結(jié)果提示GIOP組破骨活性較低，其中在M3表現(xiàn)更為明顯;與GIOP比較，各治療組隨著月齡的增加，其TRAP染色陽性結(jié)果提示破骨活性均顯著增加，PT組和PT+ALN組在M1、M2、M3時(shí)間點(diǎn)均較ALN組顯著;
　　(2)龜板對(duì)GIOP大鼠血清AKP活性及骨轉(zhuǎn)化指標(biāo)的影響
　　①各組大鼠血清AKP活性結(jié)果
　　預(yù)防實(shí)驗(yàn)在M1、M2時(shí)，

20、與SHAM組比較，GIOP組AKP活性明顯升高(P＜0.05);PT和PT+ALN組在M1和M2時(shí)間點(diǎn)顯著低于GIOP組(P＜0.05)。治療實(shí)驗(yàn)中，與SHAM組比較，GIOP組在M1時(shí)間點(diǎn)AKP顯著升高(P＜0.05)，在M2時(shí)間點(diǎn)，PT+ALN組AKP活性較GIOP組、PT組和ALN組均明顯升高(P＜0.001)。
　　②各組大鼠血清PINP和β-CTX水平比較
　　預(yù)防和治療組中，GIOP組與SHAM組比較PINP和β

21、-CTX水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但表現(xiàn)為升高趨勢(shì);與GIOP組比較，各治療組PINP和β-CTX水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均呈下降趨勢(shì)。
　　(3)龜板對(duì)大鼠椎體let-7f和Wnt/β-catenin通路相關(guān)因子的調(diào)控作用
　?、賀T-qPCR檢測(cè)預(yù)防實(shí)驗(yàn)和治療實(shí)驗(yàn)中各組椎體let-7f、TNFR2、GSK3β、β-catenin、AP-1、CTSK、MMP9、OPG、Runx2、SP7的基因表達(dá);
　　預(yù)防實(shí)驗(yàn)和治療實(shí)驗(yàn)在M3

22、時(shí)間點(diǎn)，與SHAM組比較，GIOP組let-7f、β-catenin表達(dá)顯著降低(P＜0.01)，TNFR2、GSK3β表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)，AP-1、CTSK、MMP9、OPG、Runx2、和SP7表達(dá)與SHAM組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但仍有下調(diào)趨勢(shì)。PT組和PT+ALN組let-7f、β-catenin表達(dá)顯著高于GIOP組(P＜0.05)，TNFR2、GSK3β表達(dá)顯著低于GIOP組(P＜0.05)，AP-1、CTSK、MMP9、

23、OPG、Runx2、和SP7與GIOP組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均表現(xiàn)為上調(diào)趨勢(shì)。
　?、贗HC檢測(cè)(1)中L4椎體Runx2、CTSK的蛋白表達(dá);
　　預(yù)防實(shí)驗(yàn)和治療實(shí)驗(yàn)的M3時(shí)間點(diǎn)，與SHAM組比較，GIOP組Runx2表達(dá)明顯降低，CTSK表達(dá)明顯升高;與GIOP組比較，各治療組Runx2明顯增加，CTSK表達(dá)明顯降低。其中，PT+ALN組表現(xiàn)最為顯著。
　?、踂estern-blot檢測(cè)預(yù)防實(shí)驗(yàn)和治療實(shí)驗(yàn)中各組椎體中T

24、NFR2、p-GSK3β、p-β-catenin、Runx2、CTSK蛋白表達(dá);
　　預(yù)防和治療實(shí)驗(yàn)中均顯示，與SHAM組比較，GIOP組TNFR2和p-β-catenin表達(dá)顯著升高(P＜0.01)，p-GSK3β表達(dá)顯著降低(P＜0.001)。與GIOP組比較，PT和PT+ALN組TNFR2、p-β-catenin表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，p-GSK3β表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。;
　　3.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究
　

25、　(1)龜板有效成分(PTE)對(duì)BMSCs的增殖和成骨分化作用
　　PTE干預(yù)7天，BMSCs增殖呈劑量增加，7天后各組細(xì)胞增殖呈劑量依賴性下降，30ug/ml濃度為PTE最佳干預(yù)濃度。成骨誘導(dǎo)14天后，PTE干預(yù)后的ALP陽性染色明顯較強(qiáng)，陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多。茜素紅染色顯示PTE組陽性染色細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組。
　　(2) let-7f與TNFR2的靶向調(diào)控關(guān)系
　　在轉(zhuǎn)染野生型TNFRSF1B-3'UTR載體細(xì)

26、胞中，共轉(zhuǎn)染let-7f-5p mimics的TNFRSF1B表達(dá)較共轉(zhuǎn)染NC mimics的顯著下調(diào)（P＜0.001）;而在轉(zhuǎn)染突變型TNFRSF1B-MUT載體細(xì)胞中，共轉(zhuǎn)染let-7f-5p mimics的TNFRSF1B表達(dá)與共轉(zhuǎn)染NC mimics的無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.臨床研究:通過高通量測(cè)序，我們發(fā)現(xiàn)了GIOP椎體中2個(gè)表達(dá)上調(diào)miRNA和16個(gè)表達(dá)下調(diào)miRNA; RT-qPCR

27、驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)miR-186-5p、miR-21-5p、miR-214-5p、miR-10b-5p、miR-451a五個(gè)顯著表達(dá)上調(diào)miRNAs和let-7f-5p、let-7a-5p、miR-27a-3p三個(gè)顯著表達(dá)下調(diào)miRNAs，這八個(gè)miRNAs在GIOP發(fā)病中可能起重要調(diào)控作用;基于測(cè)序數(shù)據(jù)、驗(yàn)證結(jié)果及生物信息學(xué)分析結(jié)果，通過查詢KEGG Pathway數(shù)據(jù)資源，我們預(yù)測(cè)，Let-7f-5p可能靶向TNFR2調(diào)控Wnt/β-ca

28、tenin通路是GIOP的發(fā)病機(jī)理。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究:
　　(1)龜板防治GIOP骨損害具有明顯效果，并與ALN聯(lián)合應(yīng)用在骨量、骨微細(xì)結(jié)構(gòu)、骨生物力學(xué)及骨組織形態(tài)學(xué)等方面均顯示出較好的聯(lián)合效應(yīng)和優(yōu)勢(shì);
　　(2)大鼠應(yīng)用或撤退GC后，AKP活性均呈現(xiàn)先上升，后逐漸降低的趨勢(shì);龜板和龜板聯(lián)合ALN能逆轉(zhuǎn)前期GC誘導(dǎo)的AKP活性升高和后期GC誘導(dǎo)的AKP活性降低。
　　(3)本研究證實(shí)，在GIOP大鼠腰椎中，在

29、基因?qū)用?，let-7f表達(dá)下調(diào)，其靶基因TNFR2上調(diào)，Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵因子GSK3β上調(diào)，β-catenin下調(diào)，而在蛋白層面，TNFR2上調(diào)，p-GSK3β下調(diào)，p-β-catenin上調(diào)，從而導(dǎo)致游離β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)減少，最后檢測(cè)到核轉(zhuǎn)錄因子Runx2蛋白表達(dá)升高，應(yīng)用龜板或龜板聯(lián)合阿倫磷酸鈉干預(yù)后能逆轉(zhuǎn)GC誘導(dǎo)的let-7f下調(diào)和Wnt/β-catenin通路的抑制。從而驗(yàn)證了本研究的假說。
　　3.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研