Wnt-β-catenin信號(hào)通路在肺纖維化形成中的機(jī)制研究.pdf

1、目的:特發(fā)性肺纖維化為致命的肺部疾病。其特點(diǎn)是肺上皮細(xì)胞損傷，肺成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)過渡沉積，造成肺結(jié)構(gòu)破壞。但機(jī)制不明。最近的證據(jù)表明，Wnt信號(hào)通路在IPF患者異?；钴S。本研究采用Wnt1蛋白干預(yù)人胚肺成纖維細(xì)胞，探討對(duì)細(xì)胞增殖、活化的影響;通過Wnt1蛋白及β-catenin質(zhì)粒干預(yù)A549細(xì)胞，探討Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)肺上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)變作用。通過模型鼠，觀察肺纖維化形成過程中，β-caten

2、in動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。用肺纖維化模型鼠的支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)HEPF和A549細(xì)胞，探討對(duì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的影響，及與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的相關(guān)性;用β-catenin基因siRNA干擾慢病毒沉默β-catenin，再用支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的影響，進(jìn)一步揭示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)成纖維細(xì)胞活化、增殖及肺上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)變的作用。
　　方法:我們用不同濃度的Wnt1干預(yù)人胚肺成纖維細(xì)胞，MTT

3、檢測細(xì)胞增殖率，RT-PCR及westenblot檢測α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白表達(dá);不同濃度的Wnt1干預(yù)A549細(xì)胞，RT-PCR及westenblot檢測E-鈣粘蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白表達(dá);然后用β-catenin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，RT-PCR及westenblot檢測E-鈣粘蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)。進(jìn)一步我們用氣管內(nèi)滴入博萊霉素構(gòu)

4、建小鼠肺纖維化模型，于造模后的第3、7、14、28天，取肺組織蘇木精-伊紅及Masson染色觀察肺組織炎癥及纖維化程度，堿水解法檢測肺組織內(nèi)羥脯氨酸含量，免疫組織化學(xué)法及westenblot檢測β-catenin蛋白的表達(dá)。用造模后第7天獲取支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞和A549細(xì)胞，RT-PCR及westenblot檢測E-鈣粘蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白及β-cateninmRNA及蛋白表達(dá)。進(jìn)一步構(gòu)建β

5、-catenin基因RNA干擾慢病毒表達(dá)載體，篩選出高效特異性抑制β-atenin基因的shRNA慢病毒載體。將β-cateninsiRNA慢病毒轉(zhuǎn)染人胚肺成纖維細(xì)胞和A549細(xì)胞，再用肺纖維化模型鼠支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)細(xì)胞，RT-PCR及westenblot檢測E-鈣粘蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白mRNA及蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:不同濃度Wnt1干預(yù)人胚肺成纖維細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞增值，尤其當(dāng)濃度大于20μg/l，細(xì)

6、胞增殖更明顯，并且α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白mRNA及蛋白表達(dá)增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。Wnt1干預(yù)A549細(xì)胞E-鈣粘蛋白mRNA及蛋白表達(dá)減少，而α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白mRNA及蛋白表達(dá)增加，尤其當(dāng)Wnt1濃度大于20μg/l時(shí)，變化更明顯。β-catenin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，由原來的鵝卵石狀變成了梭型，同時(shí)E-鈣粘蛋白mRNA及蛋白表達(dá)減少，而α-平滑肌肌動(dòng)蛋白

7、、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白mRNA及蛋白表達(dá)增加。我們用博萊霉素氣管內(nèi)滴入，構(gòu)建小鼠肺纖維化模型，與對(duì)照組比較，在纖維化形成過程中，肺組織中β-catenin蛋白表達(dá)第7天升高，表達(dá)高峰在第14天，第28天下降，但仍高于第7天。為了探討肺泡上皮細(xì)胞損傷后誘導(dǎo)肺組織異常修復(fù)，在肺組織纖維化形成中與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)系，我們用肺纖維化模型鼠第7天支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋

8、白mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著增加，而且與β-catenin相關(guān)。轉(zhuǎn)染慢病毒β-cateninsiRNA的人胚肺成纖維細(xì)胞后，再用肺纖維化模型鼠支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)細(xì)胞，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白mRNA和蛋白沒有顯著增加。我們又用小鼠肺纖維化模型第7天支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)A549細(xì)胞，結(jié)果顯示表達(dá)間質(zhì)特異性標(biāo)記物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白升高，而上皮標(biāo)記物E-鈣粘蛋白減低，與β-catenin升高有關(guān)。當(dāng)

9、我們預(yù)先用β-cateninsiRNA慢病毒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，再用肺纖維化模型鼠的支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)A549細(xì)胞，結(jié)果顯示α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白升高不明顯，E-鈣粘蛋白也無明顯下降。
　　結(jié)論:我們的研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積;Wnt/β-catenin信號(hào)通路可誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)變，從而增加成纖維細(xì)胞/肌纖維細(xì)胞的數(shù)