卵巢上皮性癌中Wnt-β-catenin信號(hào)通路對(duì)間皮素基因的表達(dá)調(diào)控.pdf

1、人卵巢上皮性癌(Epithelial ovarian cancer, EOC，以下簡稱卵巢癌)起源于人卵巢表面上皮(ovarian surface epithelium，OSE)。本課題首先從經(jīng)典Wnt信號(hào)通路成分Wnt-1和β-catenin入手，檢測(cè)其mRNA與蛋白在卵巢癌中的表達(dá)情況，以明確在卵巢癌中是否存在Wnt信號(hào)通路的異常激活，并同時(shí)檢測(cè)間皮素基因的表達(dá)，分析二者的相關(guān)性，初步探討卵巢癌中Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)

2、控間皮素表達(dá)的可能性。進(jìn)一步以SKOV-3細(xì)胞為例，探討用LiCl和Wnt-3a重組蛋白處理SKOV-3細(xì)胞模擬激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路后，和用β-catenin靶向的RNAi慢病毒阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路后，間皮素基因的表達(dá)變化，以明確在體外Wnt/β-catenin信號(hào)通路是否對(duì)間皮素的表達(dá)有調(diào)控作用。最后，我們深入探討了Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控間皮素基因的機(jī)制，通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析間皮素

3、基因的5'調(diào)控區(qū)及可能存在的調(diào)控元件，以雙熒光酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)間皮素基因啟動(dòng)子區(qū)的核心區(qū)域，并用電遷移率改變分析實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所預(yù)測(cè)的調(diào)控元件的作用，闡明Wnt/β-catenin信號(hào)通調(diào)控間皮素基因表達(dá)的具體機(jī)制。本文主要從以下幾部分展開論述:
　　第一部分 Wnt/β-catenin信號(hào)通路成分與間皮素在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性
　　目的:探討卵巢上皮性癌組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路成分Wnt-1和β-c

4、atenin與間皮素基因的表達(dá)，并分析其相關(guān)性。
　　方法:用real-time PCR方法檢測(cè)31例卵巢上皮性癌組織、20例良性卵巢上皮性腫瘤和10例正常卵巢上皮中經(jīng)典Wnt信號(hào)通路成分Wnt-1和β-catenin基因和間皮素基因的mRNA的表達(dá)，并分析其在轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)的相關(guān)性。
　　用免疫組化EliVison法檢測(cè)57例上皮性卵巢癌組織、20例良性卵巢上皮性腫瘤和16例正常卵巢上皮中Wnt-1、β-catenin基因和間皮

5、素的蛋白表達(dá);分析三者在不同組織類型、手術(shù)-病理分期間表達(dá);分析間皮素與Wnt信號(hào)通路異常的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.卵巢癌組織中Wnt-1 mRNA的表達(dá):Wnt-1 mRNA在卵巢癌組織中陽性表達(dá)率為22.6％(7/31)，陽性標(biāo)本中相對(duì)表達(dá)量為0.64±0.06。卵巢良性腫瘤中有15％(3/20)為Wnt-1陽性表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量為0.47±0.04。正常卵巢上皮組織中未檢測(cè)出Wnt-1 mRNA表達(dá)(0/10)。卵

6、巢癌與良性卵巢腫瘤間Wnt-1 mRNA陽性率無差異（x2=0.443，P＞0.05）。卵巢癌與卵巢良性腫瘤間Wnt-1 mRNA陽性者表達(dá)量無差異（t=4.324，P＞0.05）。因卵巢癌中Wnt-1 mRNA陽性表達(dá)例數(shù)較少，未在不同病理類型及病理分期間比較。
　　2.卵巢癌組織中β-cateninmRNA的表達(dá):β-catenin mRNA表達(dá)于所有的組織標(biāo)本。卵巢癌中β-catenin mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.77±0.

7、46，卵巢良性腫瘤中為0.70±0.46，卵巢上皮組織中相對(duì)表達(dá)量為0.71±0.45，除透明細(xì)胞癌因例數(shù)少未參加統(tǒng)計(jì)外，β-catenin在漿液性、粘液性和子宮內(nèi)膜樣癌間表達(dá)無差異（F=0.55，P＞0.05）。不同病理分期間Ⅲ～Ⅳ期β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.96±0.06，高于Ⅰ～Ⅱ期的相對(duì)表達(dá)量0.70±0.03(t=-0.189,P＜0.05)。
　　3.卵巢癌組織中間皮素基因mRNA表達(dá)。
　　4

8、.Wnt-1蛋白在卵巢癌組織中表達(dá)。
　　5.β-catenin在卵巢癌組織中異位表達(dá)。
　　6.間皮素蛋白在卵巢癌組織中表達(dá)。
　　7.間皮素蛋白表達(dá)與Wnt-1/β-catenin通路異常的相關(guān)性。
　　結(jié)論:上皮性卵巢癌中存在Wnt/β-catenin信號(hào)通路成分和間皮素的異常表達(dá);經(jīng)典Wnt/β-catenin通路異常和間皮素表達(dá)與高手術(shù)-病理分期相關(guān);在上皮性卵巢癌中間皮素表達(dá)與經(jīng)典Wnt/β-cate

9、nin通路異常有關(guān)。
　　第二部分 SKOV-3細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)間皮素基因表達(dá)的調(diào)控
　　目的:通過體外實(shí)驗(yàn)，觀察卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3中分別激活與抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路后，間皮素基因的表達(dá)變化，以揭示經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)間皮素基因表達(dá)有無實(shí)際調(diào)控作用。
　　方法:
　　1.檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3中間皮素基因的基礎(chǔ)表達(dá)水平。
　　2.L

10、iCl和Wnt-3a處理SKOV3細(xì)胞，KCl和正常培養(yǎng)基處理為對(duì)照，檢測(cè)β-catenin的表達(dá)情況。評(píng)估LiCl和Wnt-3a激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路的細(xì)胞模型。
　　3.構(gòu)建針對(duì)β-catenin基因的RNAi慢病毒，空載體慢病毒為對(duì)照，轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞后，觀察其對(duì)Wnt信號(hào)通路的干擾效果。
　　4.Real-time PCR和westem blot方法分別檢測(cè)激活與阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通

11、路后間皮素基因的mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。
　　結(jié)論:在SKOV-3細(xì)胞中，經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)間皮素基因的表達(dá)有調(diào)控作用，激活該信號(hào)通路可的上調(diào)間皮素基因的表達(dá)，但阻斷β-catenin不能有效下調(diào)間皮素基因的表達(dá)。
　　第三部分 人間皮素基因5'調(diào)控區(qū)生物信息學(xué)分析及相關(guān)調(diào)控元件初步鑒定
　　目的:生物信息學(xué)方法利用各種生物信息數(shù)據(jù)庫分析間皮素基因5'調(diào)控區(qū)相關(guān)信息，預(yù)測(cè)并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證間皮素基因

12、的核心啟動(dòng)子區(qū);預(yù)測(cè)并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證調(diào)控間皮素基因啟動(dòng)子區(qū)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，分析Wnt信號(hào)調(diào)控間皮素表達(dá)的方式。
　　方法:
　　1.綜合間皮素基因更新信息。
　　2.結(jié)合間皮素基因啟動(dòng)子區(qū)及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)位置的不同，構(gòu)建不同長度間皮素啟動(dòng)子序列報(bào)告基因載體，轉(zhuǎn)染卵巢癌SKOV-3及3AO細(xì)胞系，用雙熒光酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)不同長度啟動(dòng)子區(qū)活性，分析相應(yīng)區(qū)域在間皮素轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用。

13、r>　　3.電泳遷移率改變分析試驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)驗(yàn)證預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合點(diǎn)的作用。
　　結(jié)果:
　　1.與原有認(rèn)為轉(zhuǎn)錄本1(GenBank accession:NM_005823)編碼MPF，轉(zhuǎn)錄本2(NM_013404)編碼間皮素，轉(zhuǎn)錄本2和1相比在N端序列存在差異，這種差異有可能來自測(cè)序錯(cuò)誤;轉(zhuǎn)錄本3(AF180951)為間皮素cDNA部分序列，且C端插

14、入82bp的認(rèn)識(shí)不同，間皮素基因轉(zhuǎn)錄本信息已更新為:轉(zhuǎn)錄本1和3均轉(zhuǎn)錄間皮素前體蛋白亞型1，轉(zhuǎn)錄本2轉(zhuǎn)錄前體蛋白亞型2。前體蛋白亞型1和2均可加工為間皮素前體蛋白，后者被剪切為MPF與間皮素。
　　2.以間皮素基因翻譯起始密碼子記作+1，以上游-4Kb序列在Blast N程序內(nèi)進(jìn)行對(duì)比分析，顯示間皮素基因5'端序列對(duì)應(yīng)EST集中在-1900～-1850左右和-1500～1430左右區(qū)域。4Kb序列對(duì)應(yīng)可翻譯為蛋白質(zhì)區(qū)位于約-270

15、0～-4000區(qū)域內(nèi)，與EST區(qū)無重復(fù)，說明對(duì)應(yīng)的EST序列可能為5'UTR。
　　3.取間皮素轉(zhuǎn)錄本2上游2Kb(-1608～-3608)序列分析可能的TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)LEF-1結(jié)合位點(diǎn)，位于-3036～-3029，和一個(gè)TCF-4結(jié)合位點(diǎn)位于-1935～-1926，后者位于所預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)。
　　4.結(jié)合所預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)位置，構(gòu)建含遠(yuǎn)端LEF-1結(jié)合位點(diǎn)及TCF-4結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)啟

16、動(dòng)子區(qū)的1764bp(-3371～-1607)片段;僅含TCF-4位點(diǎn)的預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)的472bp(-2079～-1607)片段;LEF-1與TCF-4結(jié)合位點(diǎn)均不包含的預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)的261bp(-1868～-1607)片段。測(cè)序結(jié)果顯示構(gòu)建正確。
　　5.電泳遷移率改變分析顯示熒光標(biāo)記的TCF-4探針能與核蛋白形成復(fù)合物，而突變型探針則不能，200倍未標(biāo)記的競(jìng)爭探針能競(jìng)爭掉生物素標(biāo)記的探針與核蛋白的結(jié)合，200倍未標(biāo)記的突變探針則

17、不能。且標(biāo)記探針能與重組TCF-4蛋白結(jié)合。
　　結(jié)論:
　　1.間皮素基因更新的RefSeg序列已更正了以前轉(zhuǎn)錄本2、3存在的測(cè)序誤差。轉(zhuǎn)錄本1和3均轉(zhuǎn)錄間皮素前體蛋白亞型1，轉(zhuǎn)錄本2轉(zhuǎn)錄前體蛋白亞型2。間皮素前體蛋白亞型1和2均可編碼間皮素前體蛋白。
　　2.生物信息學(xué)綜合分析顯示，間皮素基因啟動(dòng)子區(qū)可能位于2835～-1668區(qū)域。間皮素基因5'調(diào)控區(qū)內(nèi)有兩個(gè)可能的TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn):一個(gè)LEF-1結(jié)

18、合位點(diǎn)，位于-3036～-3029，一個(gè)TCF-4結(jié)合位點(diǎn)位于-1935～-1926，位于所預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)。
　　3.結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)及TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)位置設(shè)計(jì)、構(gòu)建了不同長度的啟動(dòng)子片段，轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞后，經(jīng)雙熒光酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)，鑒定了一個(gè)包含TCF-4結(jié)合位點(diǎn)的211bp間皮素核心啟動(dòng)子區(qū)。
　　4.EMSA實(shí)驗(yàn)對(duì)核心啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)預(yù)測(cè)的TCF-4結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證，證明這一位點(diǎn)是調(diào)控間皮素基因表達(dá)的順式作用元件，