神經(jīng)肽P物質(zhì)對95％氧致AECⅡ細(xì)胞損傷的氧化抗氧化作用及Wnt信號通路的相關(guān)研究.pdf

1、第一部分、神經(jīng)肽P物質(zhì)對95％氧致AECⅡ細(xì)胞損傷的氧化抗氧化作用
　　背景：在新出生的早產(chǎn)兒中，由于機(jī)械通氣反復(fù)過度擴(kuò)張肺泡和肺泡導(dǎo)管，吸入高濃度氧氣產(chǎn)生大量ROS，從而引起肺氧化應(yīng)激性損傷。肺泡上皮細(xì)胞是氧化應(yīng)激性損傷的主要作用位點，由于肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞(AECⅠ)已經(jīng)高度分化，失去再生能力，因此肺泡上皮的修復(fù)完全依靠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(AECⅡ)的增殖轉(zhuǎn)分化，而高氧暴露會抑制AECⅡ細(xì)胞的增殖，促進(jìn)AECⅡ細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致肺損傷

2、修復(fù)困難或出現(xiàn)纖維化等異常修復(fù)。
　　神經(jīng)肽P物質(zhì)(SP)是由多個氨基酸組成的感覺神經(jīng)肽，具有廣泛的生物學(xué)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，SP在心肌缺血、燒傷等引起的肺損傷中會引起氣道炎癥反應(yīng)，但亦有研究發(fā)現(xiàn)，SP可刺激上皮細(xì)胞生長因子及受體表達(dá)，調(diào)控表皮干細(xì)胞遷移、分化，進(jìn)而促進(jìn)上皮損傷修復(fù)。但目前，SP在高氧肺損傷中的氧化及抗氧化作用鮮有報道。
　　目的：
　　(1)采用改良后的差異貼壁法分離培養(yǎng)19d早產(chǎn)鼠AECⅡ并鑒定，為后

3、續(xù)建立SP干預(yù)細(xì)胞氧化損傷模型奠定基礎(chǔ)。
　　(2)研究SP干預(yù)對高氧暴露下AECⅡ細(xì)胞的影響，探討SP在高氧肺損傷中氧化及抗氧化的作用。
　　方法
　　分離培養(yǎng)、純化SPF區(qū)孕19d大鼠的AECⅡ，經(jīng)改良巴氏染色鑒定細(xì)胞純度，透射電鏡鑒定細(xì)胞后，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h后，按照隨機(jī)分組原則分為:1、空氣組:細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中，其中氧體積分?jǐn)?shù)為21％（21％濃度氧）;2、高氧組:細(xì)胞放入含有95％O2和5％CO2的

4、混合氣體的密閉氧倉中;3、高氧SP組:細(xì)胞培養(yǎng)液中預(yù)先加入5×10-8 mol/L的SP，再行高氧處理;4、高氧SP受體拮抗劑組:細(xì)胞培養(yǎng)液中預(yù)先加入5×10-8mol/L SP和5×10-7mol/LSP受體拮抗劑L703.606，其余處理同高氧組。各組細(xì)胞均置于5％ CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h。
　　(1)光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的生長狀況。
　　(2)激光共聚焦顯微鏡觀察各組細(xì)胞的超氧化物陰離子水平表達(dá)情況。
　　(3

5、)流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位水平。
　　(4)通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。
　　(5)化學(xué)比色法測定各組細(xì)胞內(nèi)MDA、TAOC、SOD含量。
　　結(jié)果：
　　與空氣組比較，高氧組暴露24 h，倒置顯微鏡下觀察AECⅡ明顯收縮，細(xì)胞間隙增大，部分細(xì)胞脫壁，細(xì)胞存活率和線粒體膜電位水平明顯下降，ROS含量明顯增加，超氧化物陰離子水平和凋亡率明顯升高(P＜0.05)。進(jìn)一步檢測細(xì)胞氧化損傷指標(biāo)可見細(xì)胞內(nèi)MDA

6、水平升高，而TAOC。SOD含量下降(P＜0.05)。SP干預(yù)后與高氧組比較形態(tài)學(xué)觀察可見細(xì)胞外形與空氣組接近，細(xì)胞收縮減輕，存活率和線粒體膜電位水平明顯升高，ROS含量明顯減少，超氧化物陰離子水平和凋亡率明顯下降，氧化損傷指標(biāo)MDA水平下降，而TAOC、SOD含量升高(P＜0.05)。但是，L703.606干預(yù)后SP的氧化抗氧化作用明顯降低，細(xì)胞氧化損傷與SP干預(yù)處理組比較明顯增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　SP干

7、預(yù)后可顯著降低高氧暴露下AECⅡ的凋亡，改善高氧對AECⅡ的增殖抑制，減輕高氧對AECⅡ的氧化損傷，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力。SP對高氧致AECⅡ損傷的保護(hù)作用同改善AECⅡ氧化/抗氧化失衡有關(guān)。
　　第二部分、Wnt信號在神經(jīng)肽P物質(zhì)對95％氧致AECⅡ細(xì)胞氧化抗氧化作用的機(jī)制研究
　　背景：Wnt信號通路是一種非常經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在各種生物體內(nèi)發(fā)揮重要作用，可以調(diào)控胚胎生長發(fā)育、細(xì)胞增殖分化及凋亡等。很多疾病的發(fā)病機(jī)制都

8、與Wnt信號通路的失活有關(guān)。其中Wnt經(jīng)典信號通路在肺發(fā)育、肺泡上皮細(xì)胞的增殖分化以及肺的空間構(gòu)象形成中發(fā)揮重要作用。當(dāng)Wnt信號被激活時，Wnt蛋白與Dally、FRPs蛋白結(jié)合，該蛋白復(fù)合體與細(xì)胞表面受體Frizzled/LRP結(jié)合，引起細(xì)胞胞漿內(nèi)β-catenin積聚，轉(zhuǎn)移入核內(nèi)，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。
　　前一部分已經(jīng)證明SP干預(yù)后可顯著減輕高氧對AECⅡ的氧化損傷，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力。SP對高氧致AECⅡ損傷的保護(hù)作用

9、同改善AECⅡ氧化/抗氧化失衡有關(guān)。然而SP是否通過激活Wnt經(jīng)典信號通路發(fā)揮氧化抗氧化作用，目前國內(nèi)外無相關(guān)研究報道。本實驗部分主要探討AECⅡ細(xì)胞核內(nèi)Wnt經(jīng)典信號通路在空氣、高氧環(huán)境及SP、SP受體拮抗劑干預(yù)后的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討B(tài)PD的發(fā)病機(jī)制。
　　目的：
　　探討SP干預(yù)對高氧暴露下AECⅡ的氧化抗氧化作用是否與活化Wnt經(jīng)典信號通路有關(guān)，觀察該信號通路中Wnt7b和β-catenin信號分子的變化。
　

10、　方法：
　　(1)分離培養(yǎng)孕19d的早產(chǎn)鼠AECⅡ細(xì)胞并建立細(xì)胞氧化損傷模型。
　　(2)RT-PCR檢測高氧暴露及SP干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)Wnt信號通路中Wnt7b和β-catenin基因表達(dá)水平。
　　(3)Western Blot檢測高氧暴露及SP干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)Wnt信號通路中Wnt7b和β-catenin蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　高氧暴露24小時后，AECⅡ內(nèi)Wnt7b和β-catenin信號分子的m

11、RNA和蛋白表達(dá)水平明顯減弱，與空氣組比較有顯著性差異(P＜0.05)。而高氧暴露前給予SP干預(yù)后，Wnt7b和β-catenin的mRNA和蛋白水平有所增加（P＜0.05），表明SP可激活Wnt經(jīng)典信號通路。面SP拮抗劑L703.606干預(yù)后，Wnt7b和β-catenin的mRNA和蛋白水平均有所下降(P＜0.05)，表明Wnt經(jīng)典信號通路的激活可被抑制。
　　結(jié)論：
　　高氧暴露后AECⅡ內(nèi)Wnt經(jīng)典信號通路發(fā)生了變化