HBV宮內(nèi)傳播機制的蛋白質(zhì)組學(xué)和相關(guān)miRNA研究.pdf

1、我國是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染高流行區(qū)，HBV感染及其導(dǎo)致的肝硬化和肝癌等疾病嚴重影響人們的健康。HBV主要通過血液、母嬰及性接觸傳播，其中母嬰垂直傳播主要發(fā)生在圍產(chǎn)期，阻斷母嬰傳播是目前控制HBV感染流行的關(guān)鍵，而HBV宮內(nèi)跨胎盤傳播機制是母嬰傳播阻斷研究的重點和難點。
　　HBV宮內(nèi)傳播機制主要有胎盤滲漏學(xué)說、胎盤感染學(xué)說及外周血單核細胞感染學(xué)說等幾種假說，但病毒感染宿主細胞是一個復(fù)雜的內(nèi)

2、化過程，多層次多個分子可能參與該過程，目前有關(guān)HBV跨胎盤宮內(nèi)感染的機制研究尚不夠深入也遠未闡明，亦無有效阻斷措施，深入探討HBV宮內(nèi)傳播機制對于HBV宮內(nèi)跨胎盤傳播的有效阻斷具有理論和實際意義。
　　蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可用來比較疾病與正常蛋白質(zhì)樣品間的表達水平，是揭示疾病分子機制、發(fā)現(xiàn)診斷標(biāo)志物以及尋找藥物新靶標(biāo)的有效平臺，尚未見HBV宮內(nèi)跨胎盤傳播機制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究報道。此外，病毒感染宿主細胞后，可導(dǎo)致宿主細胞中的miRNA表達

3、譜發(fā)生變化，HBV和宿主細胞之間通過miRNA進行的相互調(diào)節(jié)對于HBV宮內(nèi)感染的發(fā)生發(fā)展可能具有一定作用，亦未見相關(guān)研究報道。
　　因此，本論文利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選HBV陽性產(chǎn)婦胎盤差異表達蛋白，并建立胎盤滋養(yǎng)層細胞體外HBV感染模型，探討HBV感染后細胞中miRNA的表達變化，從蛋白質(zhì)組和miRNA兩個層次深入探討HBV如何跨胎盤宮內(nèi)傳播，可望從新的角度對HBV宮內(nèi)跨胎盤傳播的機制予以揭示。
　　方法：
　　1．以

4、HBV陽性產(chǎn)婦胎盤為研究對象，以正常產(chǎn)婦胎盤為對照，利用MALDI-TOF和ESI-MS/MS進行分析，建立正常胎盤蛋白雙向電泳（2-DE）參考圖譜；采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法，篩選HBV陽性與正常產(chǎn)婦胎盤組織的差異表達蛋白，分析評價部分差異蛋白在HBV跨胎盤傳播中的功能及意義。
　　2．體外培養(yǎng)胎盤滋養(yǎng)層細胞（JEG-3），應(yīng)用HBV陽性血清處理，采用ELISA法檢測感染細胞培養(yǎng)上清中的HBsAg、免疫組織化學(xué)SP法檢測細胞中HBs

5、Ag蛋白的表達、PCR法檢測細胞中HBV DNA的表達、AnnexinⅤ/PI雙標(biāo)法檢測細胞凋亡和壞死，透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)的變化并尋找病毒顆粒。
　　3．應(yīng)用HBV陽性血清處理JEG-3細胞，采用miRNA芯片進行處理前后細胞miRNA表達譜的比較，并對差異miRNA的靶基因進行預(yù)測和生物學(xué)功能分析。
　　結(jié)果：
　　1．建立了正常足月胎盤總蛋白2-DE參考圖譜；在pH4-10的合成圖譜上檢測到405個蛋白質(zhì)點，

6、鑒定出157個蛋白點對應(yīng)的104個蛋白，其中24個蛋白對應(yīng)多個蛋白質(zhì)點，包括細胞結(jié)構(gòu)蛋白、細胞支架蛋白等；所鑒定蛋白質(zhì)中有部分功能不明蛋白質(zhì)存在。共篩選出HBV感染產(chǎn)婦胎盤蛋白中的56個差異表達蛋白點，鑒定出24個差異蛋白；差異蛋白中有14個表達上調(diào)，10個下調(diào)；差異蛋白質(zhì)中包括了酶類、調(diào)節(jié)蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、支架蛋白、保護蛋白及功能未知蛋白等。
　　2．HBV陽性血清處理后，胎盤滋養(yǎng)層細胞JEG-3培養(yǎng)上清中HBsAg呈陽

7、性；JEG-3細胞中HBsAg和HBV DNA呈陽性；HBV陽性血清處理后細胞壞死率顯著增加，凋亡率無明顯變化；HBV陽性血清處理后JEG-3細胞超微結(jié)構(gòu)的改變表現(xiàn)為胞漿內(nèi)出現(xiàn)較多空泡狀結(jié)構(gòu)，溶酶體明顯增多，并可見病毒樣顆粒。
　　3．與正常血清處理細胞相比，HBV陽性血清處理后JEG-3細胞中高表達的miRNA包括：has-miR-197、has-miR-32、has-miR-125a-3p、has-miR-20a、has-mi

8、R-210和has-miR-574-3p；未發(fā)現(xiàn)差異顯著的低表達has-miRNA。
　　結(jié)論：
　　1．成功建立了正常足月胎盤總蛋白2-DE參考圖譜；鑒定得到104個蛋白質(zhì)，其中部分蛋白質(zhì)可能存在較多翻譯后修飾，其修飾的多樣性反映出這些蛋白在胎盤發(fā)育中的重要性；發(fā)現(xiàn)功能不明蛋白在胎盤發(fā)育過程中的存在。篩選鑒定得到HBV感染產(chǎn)婦胎盤蛋白表達譜中的24個差異蛋白；其中包括多種類別，熱休克蛋白、肌動蛋白、膜聯(lián)蛋白等差異蛋白可能與

9、HBV跨胎盤傳播有關(guān)。
　　2．HBV陽性血清可導(dǎo)致體外培養(yǎng)胎盤滋養(yǎng)層細胞的HBV感染，建立與體內(nèi)HBV感染胎盤滋養(yǎng)層細胞條件接近的細胞感染模型；HBV陽性血清可導(dǎo)致胎盤滋養(yǎng)層細胞出現(xiàn)溶酶體大量增多等形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，并可導(dǎo)致細胞壞死。
　　3．HBV陽性血清處理胎盤滋養(yǎng)層細胞后，細胞miRNA表達譜發(fā)生變化，差異表達的miRNA包括：has-miR-197、has-miR-32、has-miR-125a-3p、has-miR-