HBV準種異質(zhì)性在HBV母嬰宮內(nèi)傳播中作用的研究.pdf

1、背景與目的
　　 HBV感染是一個全球性的健康問題，經(jīng)過20年的免疫接種，15歲以下孩子中的HBsAg的攜帶率顯著下降(自10%下降至0.7%)，然而，宮內(nèi)傳播不能被HBV免疫接種阻斷，通過這種途徑感染的新生兒90%成為慢性攜帶病毒者，是造成免疫失敗的主要原因，其中有10～25%發(fā)展為肝硬化及肝細胞癌。女性患者可通過妊娠將病毒再傳遞給她們的下一代。HBV宮內(nèi)傳播的途徑主要有胎盤途徑、外周血單核細胞(peripheral bloo

2、d mononuclear cells，PBMCs)途徑及經(jīng)生殖細胞的傳播。其中胎盤的滲漏和胎盤細胞的感染是最主要的途徑，HBeAg可以經(jīng)過局部的胎盤滲漏通過胎盤，隨著胎盤屏障的破壞，造成母親的血液進入到胎兒的循環(huán)中。或者通過“細胞途徑”，可能促進了感染經(jīng)胎盤的傳播[8]。母親HBeAg血清型陽性及高病毒載量為經(jīng)胎盤HBV宮內(nèi)感染明確的正相關因素。但高危因素的孕婦所生嬰兒“有的呈慢性感染，有的卻產(chǎn)生保護性抗體”，就這一現(xiàn)象的成因而言，病

3、原學特征(HBV基因型、血清型、準種)及環(huán)境暴露因素、宿主遺傳因素(宿主易感性、基因多態(tài)性、易感基因)可能各自均發(fā)揮了重要作用，更可能是兩者交互作用的結(jié)果。
　　 妊娠狀態(tài)也改變了孕婦體內(nèi)HBV的多樣性、進化速率及演變方向。病毒可能在選擇壓力下形成免疫逃逸株，感染胎盤，突破胎盤屏障導致胎兒宮內(nèi)感染。病毒在妊娠這一新環(huán)境下，不同種群中病毒株的進化模式有何特點？核苷酸多態(tài)性分布有何差異？各蛋白編碼區(qū)在整體上的進化演變規(guī)律如何？是否受

4、到正選擇壓力的作用？突破胎盤屏障的免疫逃逸主要與哪一個或哪幾個位點有關？這些問題目的解答尚不明確。
　　 HBV基因組包含四個開放閱讀框(ORF)，分別編碼表面抗原(S區(qū))、多聚酶(P區(qū))、核心抗原(C區(qū))以及X蛋白(X區(qū))。病毒變異受到其自身復制特性、宿主遺傳背景、免疫壓力等的交互作用，由于HBV是以全長序列為遺傳單位進行復制和傳播，因此，母嬰宮內(nèi)傳播逃逸株的變異必然是全基因組范圍并且相互關聯(lián)的。基于此，對妊娠過程中HBV各編

5、碼區(qū)(尤其是免疫原性較強的C區(qū)和S區(qū))的監(jiān)測對于認識HBV宮內(nèi)傳播的機制具有重要意義。
　　 為探討上述問題，本研究收集2對病毒高載量(HBV DNA≥106copy/ml)和HBsAg及HBeAg雙陽性的發(fā)生母嬰傳播HBV宮內(nèi)感染的母親和新生兒的靜脈血樣，提取血清HBV DNA，采用PCR-克隆測序-種系進化分析方法，觀測母嬰的HBV種群之間的進化發(fā)生特點，同時以這兩位母親為傳播組，同樣病毒高載量和HBsAg及HBeAg雙陽性

6、的未發(fā)生宮內(nèi)傳播的母親為對照組，用上述方法觀察HBV準種全長序列異質(zhì)性變化，分析HBV準種全長序列變異及進化規(guī)律，從而進一步探討HBV準種異質(zhì)性在宮內(nèi)感染的作用。
　　 主要結(jié)果：
　　 一、發(fā)生宮內(nèi)傳播的兩對母嬰的HBV種群病毒株序列建立2個進化樹，表現(xiàn)為兩種特點：第一種，大部分母親株聚集為一枝，但新生兒株與小部分母親株聚集在另一枝，母親株為新生兒株的起源；第二種，母親株與新生兒株未形成總的單源群，也沒形成各自的單源群

7、，有一株新生兒的病毒株位于大部分母子序列的上游。
　　 二、對照組和傳播組各對象HBV的種系發(fā)生具有各自的特征，經(jīng)“胎盤滲漏”途徑宮內(nèi)傳播的HBV種群進化特點與未發(fā)生宮內(nèi)傳播的對照組的HBV種群進化特征類似。
　　 三、傳播組和對照組間種群平均遺傳距離(mean distance)行兩樣本t檢驗無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但種群內(nèi)部配對比較所得的遺傳距離(pariwise distance)數(shù)據(jù)庫之間，各樣本間均存在統(tǒng)

8、計學差異(P<0.05)。
　　 四、克隆測序出的不同的病毒株之間全基因組核苷酸分析，U1基因多態(tài)性最高，U4、M1基因多態(tài)性較高，U2、U3基因多態(tài)性近似，而M2基因多態(tài)性最低。RT區(qū)、X區(qū)及前C/C區(qū)和前S/S區(qū)均有基因多態(tài)性分布。U1全基因組的多態(tài)性均較高，其最高峰位于前S區(qū)；M1基因多態(tài)性較高，在S區(qū)(與RT區(qū)重疊，nt378-480之間)、X區(qū)和前C/C區(qū)有高峰分布，其最高峰位于前C/C區(qū)，次高峰位于S區(qū)；U2、U3、

9、U4各區(qū)高峰分布較均勻，最高峰位于X區(qū)或前C/C區(qū)，M2全基因組核苷酸序列總體多態(tài)性不高，最高峰位于S區(qū)(與RT區(qū)重疊，nt431-619之間)。
　　 五、在種群進化過程中，每個樣本內(nèi)部的各蛋白編碼區(qū)的非同義替換(dN)和同義替換(dS)距離均不相同。
　　 六、各樣本均未發(fā)現(xiàn)正選擇位點。
　　 主要結(jié)論：
　　 一、發(fā)生HBV宮內(nèi)傳播的兩對母嬰的HBV病毒所建立的系統(tǒng)進化樹的特點顯示，M1N1符合“胎

10、盤滲漏”的感染模式，M2N2符合“細胞途徑”的感染模式。
　　 二、傳播組與對照組之間HBV種群平均遺傳距離無統(tǒng)計學差異，P>0.05，但每個樣本組內(nèi)病毒株兩兩之間的遺傳距離數(shù)據(jù)庫行兩樣本t檢驗，則有顯著性差異，P<0.05，進一步說明HBV具有準種特性。
　　 三、經(jīng)“細胞模式”途徑發(fā)生宮內(nèi)傳播的HBV病毒株種群，遺傳距離和核苷酸多態(tài)性較小，種群內(nèi)最大的核苷酸多態(tài)性區(qū)域位于與抗原和免疫逃逸有關的S基因及“a”抗原決定簇