HBV相關性肝癌中HBV cccDNA突變位點的研究.pdf

1、目的:研究乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染導致的肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC）患者共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的表達水平及各區(qū)間位點的變異,探討HBV cccDNA不同區(qū)域核苷酸位點突變與HCC疾病的關系。基于基因表達譜數(shù)據(jù)篩選HBV感染的HCC疾病關鍵基因因子，為基因靶向性預防和治療肝癌提供參考因子。

2、r>　　方法：收集49例重慶醫(yī)科大學附屬第一和第二醫(yī)院HBV感染形成的HCC患者的血清及肝臟癌組織和配對的癌旁組織，首先檢測患者臨床病毒學指標，再用特異性熒光定量Tag Man探針方法檢測肝組織內HBV cccDNA和DNA在HCC癌組織及癌旁組織中的表達水平；然后利用滾環(huán)擴增（Roling circle amplification,RCA）技術特異性擴增癌組織及癌旁組織中肝臟內的 cccDNA。進一步分析患者癌組織和癌旁組織HBV c

3、ccDNA和 DNA表達水平的差異及cccDNA在X區(qū)和前C/C區(qū)核苷酸突變位點及突變組合與HCC發(fā)生的關系；下載Gene Expression Ominibus(GEO)數(shù)據(jù)庫中5對HBV感染的HCC配對樣本基因表達譜數(shù)據(jù)，通過生物信息學分析方法篩選與HCC直接關聯(lián)的關鍵候選因子。
　　結果：（1）在49對HCC病人中，共有35例配對的癌組織和癌旁組織的cccDNA有效檢測，cccDNA在癌組織中總體表達水平顯著低于對應的癌組織

4、（5.20 VS.9.35 copiesy/cell，p=0.0033）；配對的癌組織和癌旁組織的cccDNA經(jīng)過RCA擴增后，在X和preC/C區(qū)分別有18對和16對能有效擴增，cccDNAX區(qū)域位點突變率在癌組織中顯著高于癌旁組織（28.63％和20.94%，p=0.0313）；序列比對后發(fā)現(xiàn)X區(qū)T1721G位點和preC/C區(qū)域A1979G的突變在HCC癌組織中發(fā)生的個數(shù)顯著地高于癌旁組織（p=0.04075，OR=10.1598

5、；p=0.0155，OR=13.7529）；由T1727G突變形成的組合突變A1703G/T1727G、A1762T/G1764A/T1727G、A1703G/T1727G/A1762T/G1764A， A1979G突變形成的組合突變 A1979G/A2189、A1979G/A2189C/T/C2288A、A1979G/A2189C/T/C2288A/A2075T在癌組織中發(fā)生的次數(shù)高于癌旁組織。
　　(2)篩選得到的高風險肝癌模

6、塊中（75%）過量表達基因EGR1, FOS, DUSP1，且共同參與MAPK信號通路和下游通路細胞周期調控。
　　結論：既往文獻報道的HCC中的典型突變位點A1762T/G1764A、G1896A/G1899A等在本研究的樣本中cccDNA的X區(qū)間和preC/C區(qū)間在癌組織和癌旁組織中均有突變，且無明顯差別;發(fā)現(xiàn)的T1721G和A1979G單核苷酸突變及組合位點突變更具有特征性，它們的突變可能與HBV感染的HCC疾病的發(fā)展關聯(lián)密