斑駁病KIT基因突變位點(diǎn)與臨床表型相關(guān)性的研究.pdf

1、斑駁病(piebaldism)是一種先天性常染色體顯性遺傳性皮膚病，為單基因遺傳。臨床主要表現(xiàn)為皮膚白斑，全身各個(gè)部位皮膚均可累及，在白斑及正常皮膚可見過度色素沉著斑或咖啡斑。斑駁病患者多于出生時(shí)即可見白斑，幼年期白斑的分布及形狀逐漸趨于穩(wěn)定，并不再發(fā)生變化。組織病理學(xué)顯示白斑部位黑色素細(xì)胞完全缺失。
　　 目前研究表明斑駁病與KIT基因突變和SLUG基因缺失相關(guān)。KIT基因的作用是編碼一種細(xì)胞表面受體，即酪氨酸激酶(RTK)，

2、是一個(gè)包含976個(gè)氨基酸的多肽鏈，其由細(xì)胞外的配體結(jié)合位點(diǎn)、一個(gè)短的信號(hào)跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)（包含兩個(gè)RTK活性部分）3部分組成，屬于RKT家族成員中的第三類型。KIT受體的配體是肥大細(xì)胞/干細(xì)胞生長(zhǎng)因子。KIT受體依賴配體結(jié)合的信號(hào)傳導(dǎo)是由配體與受體和細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶位點(diǎn)形成二聚體后實(shí)現(xiàn)的。KIT基因突變導(dǎo)致受體酪氨酸激酶功能下降或失活，信號(hào)傳導(dǎo)功能受損，胚胎發(fā)育期成黑素細(xì)胞的增殖和遷移發(fā)生障礙，從而導(dǎo)致斑駁病的發(fā)生。另外，Sanche

3、z-Martin在2003年證實(shí)了SLUG基因是斑駁病的另一個(gè)致病基因。編碼蛋白為SLUG蛋白，又稱鋅指神經(jīng)嵴轉(zhuǎn)錄因子，由5個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)組成，是鋅指蛋白基因家族的一員。SLUG基因在胚胎期神經(jīng)嵴衍生的細(xì)胞發(fā)育中起重要作用，可調(diào)節(jié)表達(dá)KIT神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移，從而影響黑素細(xì)胞的發(fā)育。
　　 據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約75％的斑駁病患者是由KIT基因突變引起。Richard研究表明KIT基因突變位點(diǎn)與臨床表型存在著密切的關(guān)系，發(fā)生在KIT基因不同位點(diǎn)

4、的突變將導(dǎo)致不同的臨床表型。根據(jù)不同KIT不同位點(diǎn)發(fā)生的突變，可將臨床表型分為輕中重三型。KIT基因細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶活性區(qū)域發(fā)生的突變，主要是錯(cuò)義突變，導(dǎo)致氨基酸替換，形成異常的KIT受體蛋白，導(dǎo)致重的臨床表型。這是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶活性部位發(fā)生雜合突變的患者，1/4的二聚體是由異常KIT受體蛋白組成，1/2的二聚體由一個(gè)正常的KIT受體蛋白和一個(gè)異常的KIT受體蛋白組成，這兩部分二聚體都是無活性的，而只有當(dāng)兩個(gè)正常的KIT受體蛋白形

5、成二聚體時(shí)，才具有活性。因此，雜合突變的的患者75％ RTK二聚體功能失活，臨床上表現(xiàn)為重型。細(xì)胞外配體結(jié)合域編碼序列的突變導(dǎo)致無功能的受體KIT蛋白的產(chǎn)生，雜合突變的患者僅有1/2的KIT受體蛋白正常表達(dá)，這會(huì)導(dǎo)致KIT受體依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路出現(xiàn)劑量不足的效應(yīng)，表型較輕。而發(fā)生在橫跨膜區(qū)附近的突變，可能是移碼突變或剪接位點(diǎn)突變，導(dǎo)致翻譯提前終止，產(chǎn)生截短的或不完全的KIT受體蛋白，異常的KIT受體蛋白仍能與配體結(jié)合形成二聚體，這對(duì)正常

6、的KIT受體蛋白有抑制作用，但是這種異常受體形成的二聚體不穩(wěn)定，雜合突變患者RTK二聚體的活性在正常范圍的1/4-1/2之間波動(dòng)，導(dǎo)致臨床表型介于輕型與重型之間，臨床表現(xiàn)為中型。
　　 斑駁病KIT基因突變位點(diǎn)與臨床表型存在著復(fù)雜的關(guān)系，但目前國(guó)內(nèi)對(duì)斑駁病的研究甚少，國(guó)內(nèi)尚未開展斑駁病KIT基因突變位點(diǎn)與臨床表型關(guān)系的研究。國(guó)人斑駁病患者KIT基因的突變熱點(diǎn)，及其與臨床表型的關(guān)系是否與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道相一致，目前尚不清楚，有必要對(duì)其

7、進(jìn)行研究。鑒于目前尚無根治本病的方法，鑒定致病基因是進(jìn)行產(chǎn)前診斷、基因治療的必經(jīng)之路。本實(shí)驗(yàn)的目的旨在對(duì)所收集家系成員進(jìn)行KIT基因突變檢測(cè)，并分析其與臨床表型的關(guān)系。
　　 本次實(shí)驗(yàn)收集了2個(gè)家系，疾病經(jīng)由廣東省人民醫(yī)院皮膚科醫(yī)生診斷，收集的家系1成員共12人，其中患者5人;家系2成員11人，其中患者9人。診斷標(biāo)準(zhǔn)主要根據(jù)患者特有臨床表現(xiàn)先天性額前中央白斑，軀干、四肢白斑，白斑的形狀及分布不隨年齡的增長(zhǎng)而改變，另外家族遺傳信息

8、，最后確診為斑駁病。經(jīng)知情同意后，采集患者、家系中絕大部分正常成員及50例健康對(duì)照外周靜脈血，基因組DNA提取;設(shè)計(jì)引物，覆蓋了KIT基因的全部編碼區(qū)和外顯子-內(nèi)含子交界區(qū);利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出上述區(qū)域;將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳、純化后送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行正反向測(cè)序（采用ABI-PRISM3730測(cè)序儀進(jìn)行直接測(cè)序，測(cè)序試劑為BigDyeterminator v3.1）;測(cè)序結(jié)果用chromas軟件分析，所得序列與Pub

9、Med Genebank所公布的KIT基因序列進(jìn)行比對(duì)。同時(shí)對(duì)這兩個(gè)家系中患者白斑面積占體表面積的百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，利用SPSS13.0軟件，對(duì)這兩個(gè)家系患者白斑面積占體表面積百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述分析，并進(jìn)行兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，分析兩家系臨床表型是否有差異及家系中各患者臨床表型的差異大小。
　　 本研究發(fā)現(xiàn)，在KIT基因的編碼區(qū)共發(fā)現(xiàn)2個(gè)堿基突變位點(diǎn)，其中家系1患者是已知突變c.1861G＞A(p.Ala621Thr)，家系2患者

10、是新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)c.2564A＞G(p.Tyr855Cys)。對(duì)其臨床表型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，家系1患者臨床表型輕重不一?；颊撷?14僅額部、雙小腿至膝關(guān)節(jié)見白斑，其余部位未見皮損，白斑面積約占體表面積11％，臨床表現(xiàn)相對(duì)較輕，而患者Ⅳ-1頸部、軀干、四肢均見大片白斑，約占體表面積50％，臨床表現(xiàn)較重。家系中其余患者介于兩者之間。家系2中，先證者額前發(fā)際中央見小片白斑及白色額發(fā)，雙小腿見小片狀白斑，其上可見色素正常的皮島，白斑面積約占體表面

11、積5％。家系中其余患者臨床表現(xiàn)與先證者類似，其中患者Ⅲ-2，Ⅲ-7，Ⅳ-1，Ⅳ-3，Ⅳ-8可見白色額發(fā)，而患者Ⅱ-1，Ⅳ-8在左腹部見小片狀白斑。該家系中所有患者白斑面積占體表面積平均值為4.44％，臨床表現(xiàn)較輕。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，家系1中R1=39，M1=21.5;家系2中R2=8.5，M2=4;兩家系樣本進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，Z=3.003，P=0.003（雙側(cè)），確切概率檢驗(yàn)的P=0.001，均小于0.05，兩家系患者白斑占體表面積的百分比

12、的分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，家系1患者皮損比家系2嚴(yán)重，家系1中各患者臨床表型差異較大。
　　 本研究發(fā)現(xiàn)兩個(gè)位于酪氨酸激酶活性區(qū)域內(nèi)的突變位點(diǎn)導(dǎo)致輕重不一的臨床表型，推測(cè)這兩個(gè)家系患者除了存在目前所發(fā)現(xiàn)的c.1861G＞A(p.Ala621Thr)、c.2564A＞G(p.Tyr855Cys)突變導(dǎo)致其出現(xiàn)斑駁病表現(xiàn)外，可能還存在有其它未知因素在起調(diào)控作用，例如存在修飾基因，影響了該突變基因的完全外顯性。此外，環(huán)境因素亦可能對(duì)其外顯