CD39+Tregs在慢性HBV感染中的作用研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 乙型肝炎病毒(HBV)屬于嗜肝非細(xì)胞病變的DNA病毒，能誘導(dǎo)不同嚴(yán)重程度的各種壞死性肝炎。HBV持續(xù)感染可導(dǎo)致慢性肝炎，可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化和肝癌。雖然對于HBV感染慢性化的潛在機(jī)制研究已經(jīng)有很多的闡述，但究竟是什么原因?qū)е铝寺浴BV患者體內(nèi)的抗病毒免疫應(yīng)答低下，目前還不完全清楚。有大量的文獻(xiàn)表明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)在慢性乙型肝炎中抑制機(jī)體的抗病毒T細(xì)胞反應(yīng)中扮演了重要角色。但是目前文獻(xiàn)關(guān)于Tre

2、g細(xì)胞在HBV感染慢性化的作用機(jī)制還存有爭議，一些研究認(rèn)為：與正常對照組和HBV急性感染恢復(fù)期相比，HBV病毒攜帶者在外周血和肝臟中的Treg頻率增高，并且與HBV DNA病毒載量呈正相關(guān)，認(rèn)為Treg細(xì)胞有利于HBV病毒的持續(xù)感染；然而，也有一些研究卻沒能檢測到正常對照和HBV病毒攜帶者在外周血中Treg頻率的差異。導(dǎo)致這些研究結(jié)果不一致的原因有：
　　 1)在HBV感染中對Treg細(xì)胞的表型和功能的界定標(biāo)準(zhǔn)不一樣。比如，有些

3、研究中只采用CD4+CD25+來界定Treg細(xì)胞，有些研究中用CD4+CD25highFoxp3+來界定Treg細(xì)胞；
　　 2)要精確將慢乙肝患者進(jìn)行免疫學(xué)分期，HBV慢性感染的不同階段其機(jī)體內(nèi)的免疫學(xué)狀態(tài)是徹底不同的。
　　 與小鼠的Treg細(xì)胞不一樣，人體內(nèi)的Treg細(xì)胞在表型和功能都是異質(zhì)、可塑的一群細(xì)胞。Treg細(xì)胞通過不同的功能分子執(zhí)行抑制效應(yīng)，比如IL-10、TGF-β、顆粒酶B、穿孔素、CTLA-4、GI

4、TR、Lag-3和CD39/CD73等。Treg細(xì)胞可能在不同的疾病或者疾病的不同階段使用不同的抑制機(jī)制發(fā)揮作用。
　　 2007年有兩家實(shí)驗(yàn)室分別鑒定了在人和小鼠的Treg細(xì)胞表面大量表達(dá)CD39分子。CD39分子是一種鈣、鎂離子依賴的胞外三磷酸核苷雙磷酸水解酶，其主要作用將胞外ATP和ADP水解為AMP，AMP又可在胞外5'-核苷酸酶CD73的作用下水解為腺苷，腺苷可與效應(yīng)T細(xì)胞膜上的A2AR結(jié)合，從而啟動cAMP依賴的免疫

5、負(fù)調(diào)。有文獻(xiàn)報(bào)道與CD25和CTLA-4相比，CD39分子更適合做Treg的表面標(biāo)志來篩選Treg細(xì)胞。已有的研究提示，CD39+Treg細(xì)胞在很多疾病中發(fā)揮了重要的作用：
　　 1)CD39+Treg細(xì)胞的比例增多，抑制了CD8+CTL細(xì)胞的活化，形成免疫忽視，比如在頭頸癌、HIV感染、和淋巴瘤等；
　　 2)CD39+Treg細(xì)胞的比例減少，滅活A(yù)TP危險(xiǎn)信號的能力減弱，有利于DC的成熟，并促進(jìn)DC分泌促炎因子IL-

6、1β，繼而促進(jìn)Th17的活化，發(fā)揮促炎效應(yīng)，比如在IBD、MS、SLE和移植排斥反應(yīng)等疾病。
　　 雖然CD39+Treg細(xì)胞在一些疾病中的重要作用已有研究報(bào)道，但是，目前還沒有CD39+Treg細(xì)胞參與HBV感染慢性化的研究報(bào)道。慢性HBV感染的免疫分期分為免疫耐受期、免疫清除期、低復(fù)制期和再活躍期，免疫清除期和免疫耐受期的機(jī)體免疫學(xué)狀態(tài)是徹底不同的，而CD39+Treg細(xì)胞既可以抑制效應(yīng)T細(xì)胞清除病毒，導(dǎo)致免疫耐受，又可以滅

7、活A(yù)TP信號，減少促炎因子的分泌，有利于抑制炎癥。因此，我們推測：CD39+Treg細(xì)胞可能在HBV慢性化的進(jìn)程中發(fā)揮了重要的作用。在我們的研究中，我們首先鑒定了CD39+Treg細(xì)胞的表型和功能；接著我們將收集的研究對象分為四組：健康對照組、AsCs(無癥狀的免疫攜帶者)、CAH組(慢性活動性肝炎)和ACLF組(慢加急性肝衰竭)，分析了這四組研究對象的外周血和肝內(nèi)的CD39+Treg的頻率和表型特點(diǎn)；最后，用Spearman's相關(guān)性

8、檢驗(yàn)方法分析了CD39+Treg的頻率和臨床指標(biāo)的相關(guān)性。通過以上研究擬為HBV感染慢性化的機(jī)制找尋一條新的線索。
　　 結(jié)果：
　　 1.CD39分子主要表達(dá)在FoxP3high的效應(yīng)性Treg細(xì)胞表面
　　 在我們的研究中，通過流式檢測發(fā)現(xiàn)，無論是健康人還是不同分期的HBV患者，CD39分子在CD4+T細(xì)胞的表達(dá)頻率個(gè)體之間差異很大，從0.5％到20％，且其表達(dá)的高低與后續(xù)的CD39分子在Treg細(xì)胞上的分布

9、相關(guān)聯(lián)。因此，為了對后續(xù)CD39分子與HBV感染的研究更為詳細(xì)，我們根據(jù)分析數(shù)據(jù)后所得到規(guī)律，把所有研究對象按CD39分子在CD4+T細(xì)胞上的表達(dá)高低將其分為CD3910w組(<5％)、CD39int組(5-10％)和CD39high組(>10％)。首先，我們對CD39+Treg細(xì)胞的表型和功能進(jìn)行鑒定，研究結(jié)果提示：1)CD39分子在CD4+T細(xì)胞的表達(dá)高低影響了其在Treg細(xì)胞上的分布，CD39+Treg細(xì)胞占總Treg比例的平均值

10、為：CD39low(17％)、CD39int(45％)and CD39high(65％)。2)但是無論CD39分子的表達(dá)高低，70％以上的CD39分子都表達(dá)在CD45RA的記憶表型的CD4+T細(xì)胞中。
　　 Sakaguchi實(shí)驗(yàn)室以CD45RA和FoxP3兩個(gè)標(biāo)記將人的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分為三個(gè)亞群：CD45RA+Foxp3low靜息態(tài)Treg細(xì)胞、CD45RA-Foxp3high效應(yīng)態(tài)Treg細(xì)胞和CD45RA-Foxplow分泌

11、態(tài)Treg細(xì)胞，他們的研究結(jié)果表明這三個(gè)亞群能很好地評價(jià)不同生理和病理情況下Tregs的分化動力學(xué)。我們也檢測了CD39分子在上述三個(gè)Treg亞群中的表達(dá)情況，結(jié)果表明：CD39分子主要表達(dá)在CD45RA-FoxP3high效應(yīng)態(tài)的Treg細(xì)胞群中。我們還進(jìn)一步檢測了在Treg細(xì)胞中CD39分子與其他Treg重要功能分子的共表達(dá)情況，結(jié)果提示：與CD39-Treg細(xì)胞相比，CD39+Treg與CTLA-4、Ki-67和HLA-DR共表達(dá)

12、的頻率高出一倍。最后，我們還做了CD39+Treg細(xì)胞的抑制功能實(shí)驗(yàn)，結(jié)果提示：CD39+Treg細(xì)胞的抑制功能較CD39-Treg細(xì)胞更強(qiáng)。
　　 2.CD39+Treg細(xì)胞的頻率在慢性乙肝感染的不同階段是動態(tài)變化的
　　 我們按照臨床診斷和相關(guān)檢驗(yàn)結(jié)果，將研究對象分為4組：健康對照組、AsCs組、CAH組和ACLF組，用流式方法檢測了四組人群中總Treg細(xì)胞和CD39+Treg細(xì)胞頻率，研究結(jié)果提示：1)CD39分子

13、在CD4+T細(xì)胞的頻率在四組之間沒有明顯的差異；2)CD39分子在FoxP3+Treg細(xì)胞的比例在四組中是動態(tài)變化的：與健康組相比，在AsCs組中其頻率顯著增高(P<0.05)，但在CAH和ACLF組中其頻率又顯著下降，基本恢復(fù)至健康對照組水平；3)總Treg細(xì)胞的頻率在四組中的變化趨勢卻與CD39+Treg細(xì)胞不同：與健康對照組相比，AsCs組沒有明顯變化，但在CAH和ACLF組中卻顯著升高。CAH和ACLF的特征是血清ALT水平升高

14、，肝臟局部發(fā)生肝細(xì)胞壞死和炎性細(xì)胞的浸潤，Treg頻率的升高可能是在高炎癥狀態(tài)下代償性的增高，而CD39+/Treg細(xì)胞的頻率變化有可能更真實(shí)的反映了在慢性HBV感染中從AsCs的“免疫耐受”到CAH、ACLF的“免疫過度反應(yīng)”的免疫微環(huán)境的動態(tài)變化。
　　 3.CD39+Treg細(xì)胞的頻率與HBV DNA拷貝數(shù)呈正相關(guān)，與血清ALT水平呈負(fù)相關(guān)
　　 HBV拷貝數(shù)、ALT水平和HBeAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換是評價(jià)慢乙肝疾病進(jìn)展

15、的3個(gè)重要臨床指標(biāo)。我們把總Treg和CD39+Treg的頻率分別與臨床參數(shù)做相關(guān)性分析，結(jié)果表明：1)慢乙肝患者的外周血中，CD39+Treg的頻率與HBV DNA拷貝數(shù)呈正相關(guān)，尤其是在AsCs組中，但總Treg細(xì)胞頻率未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性，這個(gè)與已有的研究報(bào)道不一致，分析原因可能是我們用來界定總Treg細(xì)胞的標(biāo)記只有CD4+FoxP3+兩個(gè)指標(biāo)，而在總Treg頻率與HBV拷貝數(shù)有相關(guān)性的研究中，界定Treg細(xì)胞用的是CD4+FoxP3+C

16、D25+三個(gè)指標(biāo)；2)慢乙肝患者的外周血中，CD39+Treg的頻率與ALT水平呈負(fù)相關(guān)，尤其是在CAH組中，但ACLF組未能發(fā)現(xiàn)相關(guān)性，分析原因可能是ACLF病人發(fā)生了“膽酶分離”的現(xiàn)象，ALT水平已不能體現(xiàn)肝局部的炎癥程度。然而，總Treg頻率未能發(fā)現(xiàn)與ALT水平有相關(guān)性；3)慢乙肝患者的外周血中，CD39+Treg的頻率與HBeAg的表達(dá)沒有相關(guān)性，分析原因可能是我們的研究對象對HBeAg的檢測是定性而不是定量，可能掩蓋了CD39

17、+Treg頻率與HBeAg水平的相關(guān)性；4)除此之外，我們還比較了CD39分子的表達(dá)高低與HBV拷貝數(shù)、ALT水平和HBeAg的相關(guān)性，結(jié)果表明：與CD39high組相比，CD39low組的血清ALT水平升高，HBV病毒載量顯著降低。這些結(jié)果再次提示：CD39+Treg細(xì)胞可能參與了HBV感染慢性化的病程。
　　 4.CD39+Treg細(xì)胞在炎癥肝局部大量浸潤
　　 我們用流式檢測了HCC病人(HBV+)手術(shù)摘除的癌旁組

18、織(HAI：S3/G3)LIL的CD39+Treg細(xì)胞的表達(dá)頻率，結(jié)果提示與外周血基本一致，CD39+Treg占總Treg細(xì)胞的46％，由于肝穿標(biāo)本的取材困難和組織太少，我們用免疫組化和免疫熒光的方法檢測了CD39+Treg細(xì)胞在肝炎組織中的定位和共表達(dá)，結(jié)果提示：CD39+FoxP3+的細(xì)胞在炎癥肝組織的匯管區(qū)內(nèi)大量浸潤。
　　 結(jié)論：
　　 在我們的研究中，我們首次將CD39+Treg細(xì)胞引入HBV慢性感染的機(jī)制研究

19、中，CD39+Treg細(xì)胞的頻率在HBV慢性化感染進(jìn)程中是動態(tài)變化的，在免疫耐受期是升高的，到免疫清除期是降低的，而且CD39+Treg細(xì)胞的頻率與慢乙肝病人的ALT水平呈負(fù)相關(guān)，與HBV DNA拷貝數(shù)呈正相關(guān)。由于CD39分子在個(gè)體之間表達(dá)差異大，我們還首次根據(jù)CD39分子在CD4+T細(xì)胞的頻率將研究對象再劃分為CD39low組、CD39int組、CD39high組。與CD39high組相比，CD39low組的ALT水平較高，HBV

20、DNA拷貝數(shù)的水平較低。我們還鑒定了CD39分子主要表達(dá)CD45RA-FoxP3high的效應(yīng)記憶Treg細(xì)胞上，且具有更強(qiáng)的抑制功能。綜上所述，通過我們的研究結(jié)果可以推測，CD39+Treg細(xì)胞在HBV感染慢性化進(jìn)程中可能發(fā)揮了重要的作用，提示CD39+Treg細(xì)胞可作為慢性HBV感染的治療和免疫監(jiān)測的一個(gè)有效的靶標(biāo)。在后續(xù)的研究中我們將關(guān)注在HBV慢性感染中，Treg細(xì)胞上的CD39分子如何被肝臟微環(huán)境調(diào)控以及發(fā)揮抑制功能的確切機(jī)制