Tim-3在慢性HBV感染介導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞耗竭中的作用及其負(fù)調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus，HBV)基因組長3.2kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。成人感染乙型肝炎病毒后約有5％發(fā)展成慢性感染，而慢性乙型肝炎(chronichepatitisB,CHB)是肝硬化和肝癌的主要原因。乙肝病毒感染的過程中，病毒本身并不會(huì)直接引起肝細(xì)胞的損傷，宿主的抗病毒免疫應(yīng)答導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷是各種肝臟疾病發(fā)生的重要機(jī)制。有文獻(xiàn)報(bào)道，CD8+T細(xì)胞通過直接對(duì)HBV感染肝細(xì)胞的殺傷作用及分泌抗病毒細(xì)胞因子兩種機(jī)

2、制來清除病毒。在慢性HBV感染過程中，病毒特異性CD8+T細(xì)胞耗竭及其免疫功能失調(diào)（弱應(yīng)答或者不應(yīng)答）是病毒持續(xù)存在的重要原因，但是其分子機(jī)制尚不清楚。
　　 T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白(Tcellimmunoglobulindomainandmucindomainprotein,Tim)基因家族是2001年發(fā)現(xiàn)的新型免疫調(diào)節(jié)基因家族。人類Tim家族定位于5q33.2，該家族包括3個(gè)成員Tim-1，Tim-3和Tim-4。人Tim-

3、3分子最初是作為Th1細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記被克隆的，其編碼蛋白由胞外段（含181個(gè)氨基酸）、跨膜區(qū)（含21個(gè)氨基酸）和胞內(nèi)區(qū)（含78個(gè)氨基酸）組成。大量研究表明，Tim-3分子在多種免疫細(xì)胞如自然殺傷細(xì)胞(naturalkillercell，NKcell)，樹突狀細(xì)胞(Dentriticcell，DC)，CD8+T細(xì)胞，Th17細(xì)胞，單核/巨噬細(xì)胞(monocyte/macrophage)表面均有表達(dá)。Tim-3與其配體galectin

4、-9結(jié)合介導(dǎo)Th1細(xì)胞凋亡及免疫耐受的形成，從而負(fù)向調(diào)節(jié)Th1型免疫應(yīng)答，在多種自身免疫性疾病如NOD(non-obesediabetic)，EAE(experimentalautoimmuneencephalomyelitis)小鼠模型中發(fā)揮重要作用。近期有研究報(bào)道，Tim-3通過抑制CD8+T細(xì)胞的應(yīng)答參與人類免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）及丙型肝炎病毒(HepatitisCviurs，

5、HCV)感染。本課題組前期研究證實(shí)Tim-3通過抑制NK細(xì)胞功能參與慢乙肝的發(fā)生。但在慢乙肝的發(fā)病過程中，Tim-3是否影響CD8+T細(xì)胞的功能尚未見報(bào)道。
　　 本課題利用臨床標(biāo)本及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究Tim-3在慢乙肝患者外周血CD8+T細(xì)胞表面的表達(dá)及其與臨床指標(biāo)相關(guān)性，進(jìn)而通過體外共培養(yǎng)及功能阻斷實(shí)驗(yàn)研究Tim-3在慢乙肝患者CD8+T細(xì)胞功能失調(diào)中的作用及其機(jī)制，為慢乙肝發(fā)病機(jī)制的研究及疾病的治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

6、　　 第一部分慢乙肝病人外周血CD8+T細(xì)胞Tim-3表達(dá)顯著升高，并介導(dǎo)病毒特異性CD8+T細(xì)胞耗竭
　　 Tim-3表達(dá)于多種免疫細(xì)胞并通過多種途徑調(diào)節(jié)固有免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答。CD8+T細(xì)胞是機(jī)體抗病毒的主要免疫效應(yīng)細(xì)胞，其數(shù)量和質(zhì)量在慢乙肝的轉(zhuǎn)歸中起著非常重要的作用。已有研究表明，Tim-3通過抑制CD8+T細(xì)胞功能參與HW及HCV慢性感染，但Tim-3是否調(diào)節(jié)慢乙肝病人CD8+T細(xì)胞功能并介導(dǎo)CD8+T細(xì)胞耗竭，迄今

7、尚未見報(bào)道。本研究首先檢測了慢乙肝病人及正常人外周血CD8+T細(xì)胞表面Tim-3的表達(dá)。
　　 1.慢乙肝病人外周血CD8+T細(xì)胞Tim-3表達(dá)明顯升高，且Tim-3表達(dá)與HBV感染相關(guān)
　　 收集56例慢乙肝患者，34例健康志愿者作為對(duì)照。流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMC)中CD8+T細(xì)胞Tim-3的表達(dá)。結(jié)果顯示:慢乙肝患者外周血CD8+T細(xì)胞中

8、Tim-3陽性細(xì)胞的百分比(p=0.0008)及平均熒光強(qiáng)度(MFI)(p=0.0005)均明顯高于健康志愿者，且HBeAg陽性的慢乙肝患者外周血CD8+T細(xì)胞表面Tim-3表達(dá)明顯高于HBeAg陰性患者(p=0.0074)。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞表面Tim-3的表達(dá)水平與患者血清HBV-DNA滴度呈正相關(guān)(r=0.3139，P=0.0298)。
　　 2.與Tim-3陰性群相比，慢乙肝患者外周血Tim-3陽性CD

9、8+T細(xì)胞表現(xiàn)為活化但功能抑制的表型
　　 本研究收集28例慢乙肝病人及12例健康志愿者外周血，流式檢測CD3+CD8+T細(xì)胞CD28及Tim-3表達(dá)，結(jié)果顯示:與健康對(duì)照組相比，CHB患者CD8+T細(xì)胞中Tim-3的表達(dá)上調(diào)主要表現(xiàn)在CD8+CD28+T細(xì)胞群(p=0.0233)而不是CD8+CD28-Ts群(p=0.2072)。為了進(jìn)一步研究Tim-3表達(dá)對(duì)CD8+T細(xì)胞的影響，本研究通過標(biāo)記Tim-3流式抗體將CD8+T細(xì)

10、胞分為Tim-3陽性群和Tim-3陰性群，流式表型分析發(fā)現(xiàn)，Tim-3陽性群CD8+T細(xì)胞表面活化標(biāo)記CD69的表達(dá)明顯增加(p=0.0072)，但顆粒酶(p=0.8430)和穿孔素(p=0.3984)的表達(dá)在Tim-3陽性群及陰性群中沒有明顯差異。結(jié)果提示CHB患者Tim-3陽性的CD8+T細(xì)胞是活化但功能受抑制的CD8+T細(xì)胞。
　　 3.Tim-3顯著抑制CHB患者CD8+T細(xì)胞增殖及其IFN-γ分泌
　　 3.1

11、CHB患者外周Tim-3+CD8+T細(xì)胞HBV抗原特異性反應(yīng)能力降低
　　 為研究Tim-3對(duì)CD8+T細(xì)胞功能的影響，本研究分離CHB患者外周PBMC，HBs抗原肽刺激后，流式細(xì)胞術(shù)比較Tim-3+CD8+T細(xì)胞及Tim-3-CD8+T細(xì)胞功能。結(jié)果顯示，HBs抗原肽刺激6h，Tim-3陽性CD8+T細(xì)胞IFN-γ表達(dá)低于Tim-3陰性群，但沒有顯著性差異(p=0.1823)。CFSE染色及流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，HBs抗原肽

12、刺激4天，Tim-3陽性CD8+T細(xì)胞群的增殖明顯弱于Tim-3陰性群(p=0.0251)。再次提示Tim-3表達(dá)升高與CHB患者抗原特異性CD8+T細(xì)胞的功能抑制相關(guān)。
　　 3.2阻斷Tim-3途徑明顯增強(qiáng)CHB患者CD8+T細(xì)胞功能
　　 為了進(jìn)一步研究Tim-3對(duì)CD8+T細(xì)胞功能的影響，本研究分離慢乙肝患者PBMC，利用Tim-3-Fc融合蛋白阻斷Tim-3信號(hào)途徑（IgG作為對(duì)照）后，HBs抗原肽刺激，研究T

13、im-3對(duì)CD8+T細(xì)胞功能的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Tim-3-Fc處理組CD8+T細(xì)胞IFN-γ的表達(dá)明顯升高(p=0.0071)，且增殖明顯增加(p=0.0206)。4.Tim-3顯著促進(jìn)慢乙肝患者外周CD8+T細(xì)胞的凋亡敏感性
　　 已有研究表明，Tim-3與其配體相互作用，介導(dǎo)CD4+T細(xì)胞凋亡。但Tim-3是否介導(dǎo)CD8+T細(xì)胞凋亡，迄今尚未見報(bào)道。
　　 4.1慢乙肝病人外周血CD8+T

14、細(xì)胞尤其是Tim-3陽性的CD8+T細(xì)胞凋亡明顯增加
　　 收集并分離健康志愿者及CHB病人PBMC，流式檢測Annexin(V)表達(dá)，分析CD8+T細(xì)胞凋亡率。結(jié)果表明，慢乙肝病人PBMC中CD8+T細(xì)胞的Annexin(V)表達(dá)較健康對(duì)照組顯著增加(p=0.0097)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞中Tim-3陽性群Annexin(V)的表達(dá)明顯高于Tim-3陰性群(p=0.0002)。結(jié)果提示，慢乙肝病人外周血中上調(diào)表達(dá)的

15、Tim-3可能增加CD8+T細(xì)胞的凋亡敏感性。
　　 4.2CHB患者Tim-3陽性CD8+T細(xì)胞對(duì)AICD敏感性顯著高于Tim-3陰性群，且CD8+T細(xì)胞凋亡比例與Tim-3表達(dá)成正相關(guān)
　　 為了進(jìn)一步研究Tim-3對(duì)CD8+T細(xì)胞凋亡的影響，本研究利用PMA、Ionmycin和抗CD3激動(dòng)性抗體體外誘導(dǎo)PBMC的活化誘導(dǎo)凋亡(activationinducedapoptosis，AICD)，進(jìn)而流式檢測CD8+T細(xì)

16、胞凋亡。結(jié)果顯示，與健康志愿者相比，CHB患者外周血CD8+T細(xì)胞的凋亡比例明顯增加(p＜0.0001)，并且Tim-3陽性的CD8+T細(xì)胞的凋亡比例顯著高于Tim-3陰性群(p=0.0018)，Tim-3表達(dá)與Annexin(V)的表達(dá)正相關(guān)(r=0.5965，p＜0.0001)。
　　 4.3封閉Tim-3途徑顯著降低CHB患者外周血CD8+T細(xì)胞的凋亡率
　　 Tim-3-Fc融合蛋白預(yù)處理CHB患者PBMC（Ig

17、G處理組為對(duì)照），封閉Tim-3途徑后，利用PMA、Ionmycin和抗CD3激動(dòng)性抗體誘導(dǎo)AICD，結(jié)果顯示，封閉Tim-3明顯降低CHB患者外周血CD8+T細(xì)胞的凋亡率(p=0.0153)。
　　 綜上所述，慢乙肝患者外周血CD8+T表面Tim-3表達(dá)顯著升高，上調(diào)表達(dá)的Tim-3抑制CD8+T細(xì)胞HBV特異性增殖及分泌抗病毒細(xì)胞因子IFN-γ能力，并促進(jìn)CD8+T細(xì)胞凋亡。提示，Tim-3是慢乙肝患者CD8+T細(xì)胞耗竭的重

18、要原因。
　　 第二部分Tim-3抑制CHB患者CD8+T細(xì)胞功能的機(jī)制研究
　　 已有文獻(xiàn)報(bào)道，Tim-3與其配體galectin-9相互作用抑制Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)Th1免疫耐受。但Tim-3抑制CD8+T細(xì)胞的機(jī)制迄今尚未見報(bào)道。本研究在第一部分基礎(chǔ)上深入研究Tim-3抑制外周CD8+T細(xì)胞功能、介導(dǎo)CHB患者CD8+T耗竭的分子機(jī)制。
　　 1.Tim-3調(diào)節(jié)慢乙肝患者CD8+T細(xì)胞功能需要其他

19、免疫細(xì)胞參與
　　 本研究第一部分研究結(jié)果顯示，Tim-3可以調(diào)控CHB患者PBMC中CD8+T細(xì)胞功能。為進(jìn)一步驗(yàn)證Tim-3對(duì)CD8+T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，本研究收集并純化CHB患者外周CD8+T細(xì)胞，進(jìn)行阻斷實(shí)驗(yàn)及共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
　　 1.1阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Tim-3抑制CHB患者外周CD8+T細(xì)胞的HBs特異性IFN-γ分泌水平依賴于其它免疫細(xì)胞的存在
　　 分離CHB患者PBMC，磁珠分選純化單核細(xì)胞，IL

20、-4和GM-CSF刺激7天后誘導(dǎo)為未成熟DC，進(jìn)而利用HBs抗原肽刺激24h誘導(dǎo)為成熟DC;同時(shí)磁珠分離純化同一個(gè)體外周血CD8+T細(xì)胞，Tim-3-Fc及對(duì)照IgG預(yù)處理40min后與上述成熟DC共培養(yǎng)(10∶1)，在HBs抗原肽刺激24h后，收集細(xì)胞，流式檢測CD8+T細(xì)胞的IFN-γ表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Tim-3-Fc處理組CD8+T細(xì)胞IFN-γ分泌水平?jīng)]有明顯差異(p=0.5552)。
　　 1.2阻斷實(shí)

21、驗(yàn)結(jié)果表明，Tim-3抑制CHB患者外周CD8+T細(xì)胞的HBs特異性增殖能力依賴于其它免疫細(xì)胞的存在
　　 同上分離純化CHB患者外周血CD8+T細(xì)胞，CSFE染色后Tim-3-Fc及對(duì)照IgG預(yù)處理40min，再與HBs抗原肽刺激成熟的同體DC共培養(yǎng)(10∶1)，在HBs抗原肽刺激7天后流式檢測CD8+T細(xì)胞增殖。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Tim-3-Fc處理組CD8+T細(xì)胞的病毒特異性增殖能力沒有明顯差異(p=0.8857)。

22、
　　 1.3阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Tim-3促進(jìn)CHB患者CD8+T細(xì)胞的凋亡敏感度依賴于其它免疫細(xì)胞的存在
　　 同上分離純化慢乙肝病人外周血CD8+T細(xì)胞，Tim-3-Fc融合蛋白預(yù)處理，封閉Tim-3通路（同型對(duì)照IgG處理組作為對(duì)照），PMA、Ionmycin和抗CD3激動(dòng)性抗體體外誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞的活化誘導(dǎo)凋亡，流式分析結(jié)果顯示，封閉Tim-3通路，不能影響純化CD8+T細(xì)胞對(duì)AICD的敏感性(p=0.4033

23、)。
　　 上述結(jié)果提示，Tim-3對(duì)CHB患者外周CD8+T的功能負(fù)調(diào)控依賴于其他免疫細(xì)胞的存在。
　　 2.NK細(xì)胞參與Tim-3對(duì)慢乙肝患者CD8+T細(xì)胞的功能抑制作用
　　 NK細(xì)胞是機(jī)體抗病毒免疫的重要固有免疫細(xì)胞。文獻(xiàn)報(bào)道在抗病毒感染過程中NK細(xì)胞不僅直接殺傷病毒感染細(xì)胞，而且對(duì)適應(yīng)性免疫應(yīng)答具有調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，HBV慢性感染者NK細(xì)胞Tim-3表達(dá)顯著升高，并抑制NK功能。本研究利用

24、磁珠分選的方法，剔除慢乙肝患者PBMC中的NK細(xì)胞后以Tim-3-Fc融合蛋白預(yù)處理，封閉Tim-3途徑，再以HBs抗原肽刺激，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD8+T細(xì)胞的IFN-γ表達(dá)及增殖情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，封閉Tim-3后，剔除NK細(xì)胞PBMC中CD8+T細(xì)胞IFN-γ的表達(dá)(p=0.9160)及增殖(p=0.5102)均沒有明顯變化。提示，NK細(xì)胞參與Tim-3介導(dǎo)的對(duì)慢乙肝患者CD8+T細(xì)胞的抑制作用。
　　 3.NK細(xì)胞

25、參與Tim-3介導(dǎo)的慢乙肝CD8+T功能抑制的分子機(jī)制
　　 眾多文獻(xiàn)已經(jīng)證實(shí)，NK細(xì)胞不僅是重要的固有免疫細(xì)胞，而且具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。NK細(xì)胞既可以通過直接接觸抑制適應(yīng)性免疫細(xì)胞，又可以通過分泌細(xì)胞因子調(diào)控適應(yīng)性免疫細(xì)胞。前述研究結(jié)果強(qiáng)烈提示，NK細(xì)胞是Tim-3抑制慢乙肝CD8+T細(xì)胞所必需的。為研究其分子機(jī)制，我們?cè)O(shè)計(jì)從兩方面進(jìn)行研究:1）NK是否表達(dá)Tim-3配體galectin-9，并通過Tim-3/galect

26、in-9相互作用抑制CD8+T細(xì)胞功能？2）本研究室前期已經(jīng)證明，Tim-3可以抑制NK細(xì)胞功能，尤其是抑制NK分泌IFN-γ;而IFN-γ具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，可以促進(jìn)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。那么，Tim-3是否通過抑制NK細(xì)胞因子分泌IFN-γ，進(jìn)而抑制慢乙肝CD8+T細(xì)胞功能？為解決上述問題，我們進(jìn)行了系列研究并取得如下結(jié)果:
　　 3.1NK表達(dá)的galectin-9參與Tim-3介導(dǎo)的對(duì)慢乙肝CD8+T功能抑制作用

27、>　　 3.1.1CHB患者外周血NK細(xì)胞高表達(dá)Tim-3配體galectin-9
　　 Galectin-9是目前已知的Tim-3的配體，已有研究表明galectin-9在單核細(xì)胞表達(dá)，但是galectin-9在其它免疫細(xì)胞的表達(dá)尚不明確。為了檢測galectin-9在PBMC各細(xì)胞亞群中的表達(dá)，本研究收集CHB患者PBMC，并用磁珠分選的方法純化CD8+T細(xì)胞及NK細(xì)胞。RT-PCR檢測galectin-9的表達(dá)。結(jié)果顯示

28、，galectin-9在PBMC，CD8+T和NK細(xì)胞均有表達(dá)，且NK細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)。提示，NK細(xì)胞可能為CD8+T細(xì)胞提供配體與Tim-3相互作用，并調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞功能。
　　 3.1.2抑制NK細(xì)胞表面galectin-9，明顯促進(jìn)CHB患者CD8+T細(xì)胞IFN-γ表達(dá)及其增殖能力。
　　 為了研究NK細(xì)胞表達(dá)的galectin-9在Tim-3介導(dǎo)的對(duì)CHB患者CD8+T細(xì)胞抑制中的作用，我們進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn):分離慢

29、乙肝PBMC，磁珠分選純化NK細(xì)胞，與galectin-9抑制劑lactose共孵育40min（sucrose作為對(duì)照），阻斷NK細(xì)胞galectin-9通路。收集上述剔除NK細(xì)胞的PBMC與Tim-3-Fc共孵育40min后，與lactose預(yù)處理的NK細(xì)胞共培養(yǎng)，HBs抗原肽刺激6小時(shí)后，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD8+T細(xì)胞的IFN-γ的表達(dá)。結(jié)果顯示，lactose處理組CD8+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ(p=0.0033)能力明顯高于sucr

30、ose處理對(duì)照組。提示，阻斷NK上的Tim-3配體能顯著促進(jìn)PBMC中CD8+T細(xì)胞IFN-γ分泌水平。
　　 同上收集去除NK后的慢乙肝PBMC，CFSE染色后經(jīng)Tim-3-Fc預(yù)處理，再與lactose預(yù)處理的同體NK細(xì)胞共培養(yǎng)，HBs抗原肽刺激5天后，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD8+T細(xì)胞的增殖。結(jié)果顯示，lactose處理組CD8+T細(xì)胞的增殖(p=0.0464)能力明顯高于sucrose處理對(duì)照組，提示，阻斷NK上的Tim-3配

31、體能顯著促進(jìn)PBMC中CD8+T細(xì)胞增殖能力。
　　 綜上，Tim-3抑制慢乙肝患者外周血CD8+T細(xì)胞功能依賴于NK細(xì)胞的存在，NK表達(dá)的galectin-9參與其中。
　　 3.2.Tim-3通過抑制NK細(xì)胞分泌IFN-γ抑制CD8+T細(xì)胞的功能
　　 有文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤病人體內(nèi)NK細(xì)胞可以抑制CD8+T細(xì)胞功能。為確實(shí)慢性HBV感染過程中NK細(xì)胞是否抑制CD8+T細(xì)胞功能，本研究首先進(jìn)行了NK細(xì)胞剔除實(shí)驗(yàn)。<

32、br>　　 3.2.1去除NK細(xì)胞后CHB患者CD8+T細(xì)胞增殖及分泌IFN-γ能力明顯增強(qiáng)
　　 收集慢乙肝病人外周血，分離PBMC，磁珠純化分離NK細(xì)胞，收集剔除NK的PBMC（PBMC作為對(duì)照），種板后，HBs抗原肽刺激，流式分析CD8+T細(xì)胞的IFN-γ表達(dá)水平。結(jié)果顯示，去除NK細(xì)胞后，CHB患者PBMC中CD8+T細(xì)胞的IFN-γ表達(dá)水平(p=0.0284)明顯增強(qiáng)。
　　 同上收集去除NK的慢乙肝病人PB

33、MC，CFSE染色后，種板，HBs抗原肽刺激，流式分析CD8+T細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果顯示，去除NK細(xì)胞后，CHB患者PBMC中CD8+T細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)(p=0.002)。
　　 上述結(jié)果提示，同腫瘤環(huán)境一樣，慢乙肝感染過程中NK細(xì)胞抑制病毒特異性CD8+T細(xì)胞的功能。
　　 3.2.2封閉NK細(xì)胞表面的Tim-3信號(hào)途徑后，CD8+T細(xì)胞的功能明顯增強(qiáng)
　　 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，慢乙肝患者NK細(xì)胞Tim

34、-3表達(dá)升高，進(jìn)而抑制NK細(xì)胞功能。但Tim-3分子是否參與NK細(xì)胞對(duì)HBV特異性CD8+T細(xì)胞的負(fù)向調(diào)節(jié)作用還未見報(bào)道。
　　 本研究利用磁珠分選的方法從慢乙肝病人PBMC中純化NK細(xì)胞，anti-humanTim-3抗體預(yù)處理封閉Tim-3信號(hào)途徑（IgG做對(duì)照）后與剔除NK細(xì)胞的同體PBMC共培養(yǎng)，HBs抗原肽刺激后，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，封閉NK細(xì)胞表面的Tim-3信號(hào)途徑可明顯上調(diào)CHB患者PBMC中HBV特異性CD8+

35、T細(xì)胞的IFN-γ表達(dá)水平(p=0.0042)及其增殖能力(p=0.0218)。
　　 3.2.3封閉CD8+T細(xì)胞表面的IFN-γ受體后，NK細(xì)胞對(duì)HBV特異性CD8+T細(xì)胞的抑制作用消失
　　 已有研究結(jié)果顯示，NK細(xì)胞在LCMV感染過程中通過分泌IFN-γ調(diào)控CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。本課題組前期研究結(jié)果表明，慢乙肝病人外周血NK細(xì)胞表達(dá)Tim-3明顯升高，并抑制NK細(xì)胞分泌IFN-γ水平，那么NK細(xì)胞是否通過該途徑進(jìn)而

36、抑制HBV特異性CD8+T細(xì)胞的功能尚不明確。
　　 本研究收集去除NK細(xì)胞的慢乙肝PBMC，平均分成兩部分，一部分與IFN-γ受體的阻斷性抗體共孵育40min以封閉IFN-γ途徑，另一部分與同型對(duì)照IgG抗體共孵育作對(duì)照）;上述兩組細(xì)胞分別與anti-humanTim-3抗體預(yù)處理的同體NK細(xì)胞共培養(yǎng)，HBs抗原肽刺激，流式細(xì)胞術(shù)檢測IFN-γ表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，IFN-γ受體封閉組CD8+T細(xì)胞病毒特異性IFN-γ

37、表達(dá)水平(p=0.0466)明顯下調(diào)。上述共培養(yǎng)體系經(jīng)CFSE染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測CD8+T細(xì)胞的增殖，結(jié)果顯示，IFN-γ受體封閉組CD8+T細(xì)胞病毒特異性增殖能力明顯下降(p=0.0020)。提示，Tim-3介導(dǎo)的NK細(xì)胞IFN-γ分泌減少是NK細(xì)胞抑制HBV特異性CD8+T細(xì)胞功能的機(jī)制之一。
　　 綜上，慢性乙肝感染過程中，上調(diào)表達(dá)的Tim-3分子抑制NK細(xì)胞分泌調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子IFN-γ，從而抑制病毒特異的CD8+T細(xì)胞