慢性HBV感染進(jìn)程中Tim-3分子對(duì)CD8+T細(xì)胞及單核細(xì)胞功能的不同調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究背景與目的：
　　慢性乙型肝炎病毒感染(chronic hepatitis B virus infection)是威脅全球的重大公共健康問(wèn)題。慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB)及慢性乙型肝炎肝硬化(hepatitis B virus related-cirrohosis，HBV-related cirrhosis)是慢性乙型肝炎病毒感染進(jìn)展的先后兩個(gè)病理階段。CHB患者主要表現(xiàn)為病毒特異性的適

2、應(yīng)性免疫功能失活，而嚴(yán)重的慢性乙型肝炎肝硬化患者則進(jìn)一步會(huì)出現(xiàn)固有免疫功能的紊亂。目前，在HBV感染自然史的不同階段，調(diào)控適應(yīng)性及固有免疫功能變化的分子機(jī)制尚不明確。T細(xì)胞免疫球蛋白及粘蛋白分子-3(T cell Immunoglobulindomain and Mucindomain protein-3，Tim-3)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的免疫調(diào)控分子，既表達(dá)于適應(yīng)性免疫細(xì)胞如CD4+及CD8+T細(xì)胞，也表達(dá)于固有免疫細(xì)胞如單核細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞

3、，肥大細(xì)胞等，因此Tim-3具有廣泛的免疫調(diào)控功能。本課題旨在研究在慢性乙型病毒性肝炎及慢性乙型肝炎肝硬化階段CD8+T細(xì)胞及單核細(xì)胞功能的分別改變，及Tim-3在慢性乙型病毒性肝炎及慢性乙型肝炎肝硬化階段分別對(duì)CD8+T細(xì)胞及單核細(xì)胞功能的調(diào)控作用，從而進(jìn)一步理解慢性HBV感染進(jìn)展的免疫學(xué)特點(diǎn)并為尋求新的治療方法提供理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.Tim-3調(diào)控CD8+T細(xì)胞功能收取125例CHB患者及招募的54例健康

4、志愿者外周血并使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)總CD8+T細(xì)胞表面Tim-3表達(dá)。同時(shí)分選CD8+T細(xì)胞，使用五聚體技術(shù)檢測(cè)HBV特異性CD8+T細(xì)胞表面的Tim-3表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)比較Tim-3+/-CD8+T細(xì)胞的表型及細(xì)胞因子分泌功能。分離患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclearcell，PBMC)，分別予HBV抗原肽段、12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(phorbol12-myristate13-aceta

5、te, PMA)/離子霉素(ionomycin)及抗人CD3抗體刺激及Tim-3通路阻斷后，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子分泌，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)分泌，羧基熒光素乙酰乙酸(carboxyflu-oresceindiacetate succinimidyl ester, CFSE)法檢測(cè)CD8+T細(xì)胞增殖。
　　2.Tim-3調(diào)控單核細(xì)胞功能
　　收取79例慢性乙型肝炎

6、肝硬化患者及31例招募的例健康志愿者外周血并使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)總CD14+單核細(xì)胞表面Tim-3表達(dá)。同時(shí)使用顯色基質(zhì)法檢測(cè)患者及健康志愿者血漿內(nèi)毒素。同時(shí)分選CD14+單核細(xì)胞，體外使用內(nèi)毒素刺激單核細(xì)胞并檢測(cè)Tim-3的動(dòng)態(tài)變化。同時(shí)比較Tim-3+/-CD14+單核細(xì)胞的表型。分離患者及健康志愿者PBMC或分選CD14+單核細(xì)胞，予內(nèi)毒素刺激及/或Tim-3通路阻斷后，流式細(xì)胞術(shù)比較患者與健康人的單核細(xì)胞的吞噬功能、細(xì)胞因子分泌及

7、HLA-DR表達(dá)，ELISA法檢測(cè)上清誘導(dǎo)型一氧化氮合酶分泌。
　　研究結(jié)果：
　　1.Tim-3調(diào)控CD8 T細(xì)胞功能
　　(1)慢乙肝患者CD8+T細(xì)胞表面Tim-3表達(dá)較健康對(duì)照升高，且Tim-3表達(dá)水平與ALT呈正相關(guān)。抗病毒治療后CD8+T細(xì)胞的Tim-3表達(dá)水平明顯下降。
　　(2)慢乙肝患者HBV特異性CD8+T細(xì)胞表面Tim-3表達(dá)水平高于CMV特異性CD8+T細(xì)胞Tim-3表達(dá)。
　　(3

8、) Tim-3+CD8+T細(xì)胞中終分化效應(yīng)記憶性細(xì)胞(terminally differentiation effectormemory, TDEM)的比例高于Tim-3-CD8+T細(xì)胞，而初始性細(xì)胞的比例低于Tim-3-CD8+T細(xì)胞。
　　(4) Tim-3+CD8+T細(xì)胞的CD127表達(dá)低于Tim-3-CD8+T細(xì)胞，而CD57表達(dá)高于Tim-3 CD8+T細(xì)胞。Tim-3+CD8+T細(xì)胞在抗原刺激后分泌IFN-γ的水平低于

9、Tim-3-CD8+T細(xì)胞。
　　(5)阻斷Tim-3通路后能夠顯著恢復(fù)病毒特異性CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌及增殖能力，但不能提高對(duì)非特異抗原刺激的應(yīng)答能力。
　　3.Tim-3調(diào)控單核細(xì)胞功能
　　(1)嚴(yán)重的慢性乙型肝炎肝硬化失代償患者CD14+單核細(xì)胞表面Tim-3表達(dá)較正常人明顯下降。
　　(2) CD14+單核細(xì)胞Tim-3表達(dá)下降與患者內(nèi)毒素血癥有關(guān)。體外LPS刺激能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞Tim-3表達(dá)下降

10、。
　　(3) Tim-3+CD14+單核細(xì)胞表達(dá)CD1a及CD83較Tim-3-細(xì)胞高，但CD80及CD86表達(dá)較低。
　　(4)嚴(yán)重的慢性乙型肝炎肝硬化失代償患者單核細(xì)胞吞噬功能較正常人為低，HLA-DR表達(dá)水平降低，而iNOS分泌能力則升高，分泌促炎細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β和抑炎細(xì)胞因子IL-10水平均升高。
　　(5)阻斷Tim-3通路可下調(diào)單核細(xì)胞吞噬功能，降低iNOS分泌水平，抑制TNF-α分泌水平而