HBV疫苗志愿接種者PBL中CD4+T、CD8+T細胞TCRβ鏈CDR3譜系中的監(jiān)測及CDR3分子特征初步分析.pdf

1、目的：
　　初步分析20例HBV（Hepatitis B virus，HBV）疫苗志愿接種者（布依族、侗族、苗族、漢族）接種前后外周血淋巴細胞(peripheral blood lymphocyte，PBL)中CD4+T、CD8+T細胞受體(T cell receptor，TCR) beta鏈各家族互補決定區(qū)3（complementaritydetermining region3，CDR3）譜系的變化，并初步分析CD8+T細胞CD

2、R3譜系和HLA-A、CD4+T細胞CDR3譜系和HLA-DR的關(guān)系;對部分HBV疫苗志愿接種者，出現(xiàn)的單或寡克隆性增生CD4+T、CD8+T細胞的家族CDR3區(qū)進行基因和氨基酸組成分析。
　　方法：
　　(1)抽取遵醫(yī)2008級民族班中各志愿者外周血非抗凝血3ml，用電化學發(fā)光法篩選乙肝五項表面標記物陰性的20例布依族、侗族、漢族、苗族乙肝疫苗志愿者;
　　(2)在0，1，6月接種HBV疫苗，完成HBV疫苗的三次接種

3、;
　　(3)并于接種前、接種第二針后14天、接種第三針后14天采集外周血樣本（15ml/次）;
　　(4)免疫磁珠法（Magnetic Activated Cell Sorting.MACS）分選各PBL樣本中的CD4+T細胞、CD8+T細胞，流式細胞儀檢測分選純度;
　　(5)提取各樣本CD4+T細胞、CD8+T細胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)TCRβ鏈26個可變區(qū)基因家族設(shè)計相應(yīng)的26條TRBV上游引物

4、，在恒定區(qū)設(shè)計一條共用的TRBC下游引物，采用熒光定量PCR(fluorescence quantitative polymerase chainreaction，F(xiàn)Q-PCR)擴增26個TRBV家族包含完整CDR3區(qū)段的cDNA; FQ-PCR熔解曲線法分析HBV疫苗志愿接種者接種前、后CD4+T、CD8+T細胞TCRβ鏈的26個TRBV家族CDR3譜系漂移的特征;
　　(6)采集20例（布依族，侗族，苗族，漢族）HBV疫苗志愿

5、接種者EDTAK2抗凝外周血5ml，提取基因組DNA，采用PCR-SBT(Sequencing based typing.SBT)法測序HLA-A、HLA-DR等位基因序列;
　　(7)選擇部分HBV疫苗志愿者接種后CD8+T和CD4+T細胞譜型圖上呈單峰的志愿者的TRBV家族PCR產(chǎn)物，在相同條件進行普通PCR后，1.5％瓊脂糖凝膠電泳膠回收純化，克隆測序，DNA tools6.0等生物信息學軟件分析CDR3區(qū)的基因和氨基酸組成

6、。
　　結(jié)果：
　　(1)20例HBV疫苗志愿接種者，完成全程接種后14天，HBV表面抗體檢測全部大于10IU/L:
　　(2)20例HBV疫苗志愿接種者，在接種后CD4+T、CD8+T細胞的26個TRBV家族CDR3的熔解曲線譜系圖中，多數(shù)家族和接種前比較無變化，但每個志愿者均出現(xiàn)一個或幾個TRBV家族CDR3的優(yōu)勢利用;
　　(3)20例HBV疫苗志愿接種者接種前和接種后CD4+T和CD8+T細胞出現(xiàn)的優(yōu)勢利

7、用TRBV家族并不相同;
　　(4) HLA位點相同的不同志愿接種者之間存在共同優(yōu)勢利用的家族;
　　(5)相同民族志愿者中，未找到顯著優(yōu)勢利用的TRBV CDR3譜系;HLA相同的志愿者中，部分由多峰變?yōu)閱畏宓募易暹M行測序，未找到完全相同的CDR3序列。
　　結(jié)論：
　　(1)20例HBV疫苗志愿者在第三次HBV疫苗后HBS-Ab滴度均大于10IU/L，提示均產(chǎn)生免疫應(yīng)答，無不應(yīng)答現(xiàn)象產(chǎn)生;HBV疫苗志愿接種者

8、接種前和接種后TCR CDR3譜系的變化，提示HBV疫苗接種誘導(dǎo)了機體相應(yīng)的T細胞應(yīng)答;
　　(2) CD4+T和CD8+T細胞出現(xiàn)的優(yōu)勢利用TRBV家族CDR3的多樣性，提示: HBV抗原的多樣性和個體之間不同的HLA分子造成了機體T細胞應(yīng)答的多樣化，同時T細胞對HBV的應(yīng)答和HLA表現(xiàn)一定的相關(guān)性;
　　(3)4個民族之間及HLA表位相同的志愿者均未發(fā)現(xiàn)完全共同的TRBV家族和CDR3區(qū)，提示HBV疫苗接種后T細胞應(yīng)答可