結(jié)核患者γδTCR中δ1、δ2基因重排特點(diǎn)及CDR3譜型分析.pdf

1、研究背景和目的： 結(jié)核病是全世界范圍內(nèi)最普遍的傳染性疾病之一，由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起，嚴(yán)重威脅人類健康。目前，全世界已有三分之一約20億人口感染了MTB，其中5％～10％的感染者發(fā)展成為活動(dòng)性結(jié)核病，每年新發(fā)病人約900萬(wàn)，死亡人數(shù)高達(dá)200-300萬(wàn)。MTB為胞內(nèi)寄生菌，其免疫主要是以CD4+ Th1細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫。T細(xì)胞通過(guò)T細(xì)胞受體(T cell recept

2、or, TCR)特異性地識(shí)別單核—巨噬細(xì)胞遞呈的抗原，TCR分別由α/β或γ/δ兩條多肽鏈通過(guò)二硫鍵連接而成的膜結(jié)合型異二聚體。其中α/β TCR在外周血中大約占95％，γ/δ TCR大約占5％。 類似于α、β鏈，TCR的γ和δ鏈分別由Vγ—Jγ—Cγ及Vδ—Dδ—Jδ—Cδ基因片段重排后編碼，由此構(gòu)成了具有不同特異性的γδ TCR分子。目前已檢出14個(gè)Vγ基因(其中6個(gè)為假基因)和10個(gè)Vδ基因(其中4個(gè)為假基因)，5個(gè)Jγ，

3、2個(gè)Cγ，3個(gè)Dδ，3個(gè)Jδ和1個(gè)Cδ片斷。TCR重排過(guò)程中，V—(D)—J的基因片段進(jìn)行重排并隨機(jī)插入核苷酸形成—高度可變區(qū)，成為互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)。通過(guò)對(duì)CDR3序列的分析，可作為判別T細(xì)胞克隆性的指標(biāo)。 本研究主要對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病患者病變局部標(biāo)本中特異性淋巴細(xì)胞TCRδ1和δ2鏈序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行克隆并測(cè)序，結(jié)果利用DNAstar、DANMAN軟件及網(wǎng)上TCR資源分析比對(duì)，進(jìn)而研究活動(dòng)性結(jié)核病患者病變局

4、部是否具有γ/δ T淋巴細(xì)胞的克隆性增殖，研究TCRδ1和δ2基因重排的特點(diǎn)及其CDR3區(qū)譜型分布，從而為進(jìn)一步揭示γδ T淋巴細(xì)胞在結(jié)核感染與免疫中所起的作用及研究MTB特異反應(yīng)性TCR四聚體奠定基礎(chǔ)。 研究?jī)?nèi)容和方法： 分離活動(dòng)性結(jié)核病人胸水(PLF)標(biāo)本和外周血標(biāo)本(PBMC)中的淋巴細(xì)胞，提取其總RNA，利用Switch Mechanism At5’—end of Reverse Transcript(SMART

5、)逆轉(zhuǎn)錄獲得全長(zhǎng)cDNA，并通過(guò)LD—PCR合成第二鏈。根據(jù)GeneBank中已有的TCRδ鏈序列，分別設(shè)計(jì)三組引物擴(kuò)增TCRδ鏈的V區(qū)、CDR3區(qū)以及C區(qū)。其中V區(qū)的上游引物應(yīng)能包括TCRδ鏈先導(dǎo)序列起始密碼，下游引物則根據(jù)V區(qū)相對(duì)保守序列設(shè)計(jì)；CDR3區(qū)的上游引物根據(jù)V區(qū)的相對(duì)保守序列設(shè)計(jì)，下游引物根據(jù)C區(qū)保守序列設(shè)計(jì)；C區(qū)的上下游引物根據(jù)C區(qū)保守序列設(shè)計(jì)(下游引物包括終止密碼)，同時(shí)在V區(qū)上游引物、C區(qū)下游引物分別引入相應(yīng)的酶切位

6、點(diǎn)。然后利用Overlap—PCR技術(shù)將TCRδ鏈的V區(qū)、CDR3區(qū)、C區(qū)拼接成完整的TCRδ全長(zhǎng)編碼序列。PCR回收產(chǎn)物連接pGEM—Teasy載體，藍(lán)白篩選得到陽(yáng)性克隆，委托公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件及網(wǎng)上資源進(jìn)行分析、比對(duì)，研究TCRδ鏈的CDR3堿基及氨基酸序列，得到不同的TCRδ鏈等位基因。將得到的不同等位基因去除TCRδ鏈跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)編碼序列，然后在C端連入編碼親水性氨基酸編碼序列和生物素化酶底物基因，克隆入表達(dá)

7、載體pMT/V5/His—A構(gòu)建分泌表達(dá)重組載體，與γ鏈分泌表達(dá)重組載體及BirA表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染S2細(xì)胞后以生物素化的二聚體的形式分泌表達(dá)于胞外。 結(jié)果： 本實(shí)驗(yàn)分別從10例活動(dòng)性肺結(jié)核患者胸水標(biāo)本和1例外周血標(biāo)本中擴(kuò)增出了完整的TCRδ鏈編碼序列，總共得到不同的δ2鏈基因型37個(gè)，δ1鏈基因型30個(gè)。 序列分析結(jié)果：將各序列通過(guò)網(wǎng)上TCR資源進(jìn)行分析后，我們可以看到δ1鏈的V區(qū)主要是DV1*01；J區(qū)以DJ1*

8、01為主，只有兩個(gè)序列的J區(qū)是DJ3*01；D區(qū)以DD3*01為主，有一部分序列的D區(qū)則同時(shí)包含DD2*01與DD3*01，有兩個(gè)序列的D區(qū)同時(shí)包含DD1*01和DD3*01。δ2鏈的V區(qū)主要是DV2*01；J區(qū)以DJ1*01和DJ3*01為主；D區(qū)以DD3*01為主，有一部分序列的D區(qū)則既包含DD2*01又包含有DD3*01，在我們所擴(kuò)增到的所有序列中，只有一個(gè)序列的D區(qū)是DD1*01。并且，在δ2鏈、δ1鏈的V區(qū)與J區(qū)之間均有N區(qū)、

9、P區(qū)的插入。 氨基酸序列分析顯示同一病例及不同病例之間CDR3區(qū)呈現(xiàn)多樣性，但是各病例之間也發(fā)現(xiàn)有一些相同或相似的氨基酸序列：標(biāo)本6、7、10具有相同的δ1鏈CDR3氨基酸序列：ALGELPSAFIYVHDKLI；標(biāo)本3、6具有相同的δ1鏈CDR3氨基酸序列：ALGERYGTGGYHTDKLI；標(biāo)本2、6具有相同的δ2鏈CDR3氨基酸序列：ACDTVDREGSWDTRQMF；標(biāo)本2、4、5、7、8、9具有相同的δ2鏈CDR3氨基

10、酸序列：ACDSVLGDT RSWDTRQMF；標(biāo)本5、8、9具有相同的δ2鏈CDR3氨基酸序列：ACDSLGDNADKLI；標(biāo)本7、9具有相同的δ2鏈CDR3氨基酸序列：ACDTLGDTSSWDTRQMF； 結(jié)論： 1.研究中采用SMART和LD—PCR的技術(shù)方法克服樣本量小的問(wèn)題，利于對(duì)一份樣本進(jìn)行多個(gè)方面的研究。 2.設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增TCRδ1、δ2鏈的V區(qū)、CDR3區(qū)及C區(qū)，采用Overlap—PCR方法