采用基于CDR3δ肽結(jié)合特性的免疫—生物化學(xué)技術(shù)策略鑒定TCRγδ所識(shí)別的新型配體——hMSH2蛋白.pdf

1、盡管人類外周血γδT細(xì)胞在整個(gè)T細(xì)胞群體中所占比例較少，但其在機(jī)體對(duì)抗感染和腫瘤的免疫應(yīng)答中的重要作用卻深受關(guān)注。然而，至今為止，γδT細(xì)胞所識(shí)別的抗原則很少被鑒定。不了解T細(xì)胞受體(TCR)γδ所識(shí)別配體，也就不可能深入了解γδT細(xì)胞的生物學(xué)功能。因此，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和鑒定TCRγδ所識(shí)別配體則成為γδT細(xì)胞研究領(lǐng)域亟待解決的突出問題。如何通過新的技術(shù)策略，來發(fā)現(xiàn)TCRγδ所識(shí)別新型配體是本研究著重考慮的科學(xué)問題，這也是進(jìn)一步了解TCRγ

2、δ抗原識(shí)別特異性和多樣性機(jī)制，揭示γδT細(xì)胞的生物學(xué)功能的關(guān)鍵問題。 TCR的抗原結(jié)合部位是由六個(gè)抗原決定簇(CDR)形成的，這六個(gè)CDR在識(shí)別抗原時(shí)作用是不相同的，其CDR3區(qū)在抗原識(shí)別時(shí)占有主導(dǎo)地位。鑒于TCR8 CDR3區(qū)(CDR38)與抗體重鏈的CDR3區(qū)在結(jié)構(gòu)和功能上的相似性，因此，我們提出了CDR3δ的一級(jí)結(jié)構(gòu)是決定TCRγδ識(shí)別抗原特異性的關(guān)鍵部位的學(xué)術(shù)假說。這一假說已為我們實(shí)驗(yàn)室前期工作所驗(yàn)證。我們根據(jù)卵巢上皮癌

3、(OEC)組織浸潤(rùn)的γδT。細(xì)胞(γδTIL)TCR的一個(gè)CDR3δ的基因序列(OT3)，人工合成了OT3肽，并通過體外一系列OT3肽與靶細(xì)胞、靶組織或來源于靶細(xì)胞的蛋白的體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證OT3肽的結(jié)合特異性，所采用的方法包括OT3肽介導(dǎo)的生物傳感器，免疫熒光技術(shù)，酶免疫技術(shù)和OT3肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，構(gòu)建了用OT3序列替代抗體重鏈CDR3區(qū)序列的OT3移植抗體OT3Ab，也進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。本研究又重復(fù)了部分上述驗(yàn)證工作。結(jié)果顯示，O

4、T3肽和OT3Ab在對(duì)靶細(xì)胞、靶組織或來源靶細(xì)胞的蛋白的結(jié)合活性上享有相似的特異性。這就證明了CDR3δ確實(shí)在TCRγδ抗原識(shí)別特異性上起關(guān)鍵作用，也提示OT3肽能作為一個(gè)特異的探針，去篩選TCRγδ識(shí)別的抗原。 在上述驗(yàn)證工作的基礎(chǔ)上，本研究共采用了三種技術(shù)策略去尋找TCRγδ識(shí)別的蛋白抗原：一是以O(shè)T3肽為探針在噬菌體隨機(jī)展示十二肽庫(kù)中篩選與OT3肽結(jié)合的十二肽，通過序列比對(duì)獲得相應(yīng)蛋白；二是以O(shè)T3肽為探針在人卵巢癌cDN

5、Aλ噬菌體表達(dá)文庫(kù)篩選與OT3肽結(jié)合的克隆，通過測(cè)序鑒定蛋白；三是通過OT3肽偶聯(lián)的親和層析，從OEC腫瘤細(xì)胞系(SKOV3細(xì)胞)的總蛋白中分離與OT3肽特異性結(jié)合的蛋白，再利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白的種類。應(yīng)用第一種技術(shù)策略，我們獲得了三個(gè)OT3肽特異結(jié)合的十二肽。結(jié)合和功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，這些十二肽不但能特異性地結(jié)合TCRγδ，還能在體外促進(jìn)γδT細(xì)胞活化，提示這些十二肽具有TCRγδ的表位肽活性。然而，在BLAST比對(duì)中未發(fā)現(xiàn)與這些多

6、肽在序列上相匹配的人類相關(guān)蛋白，提示這些十二肽可能為來源于其它種屬的表位肽。篩選人卵巢癌cDNAλ噬菌體表達(dá)文庫(kù)要求探針具有較高的特異性和親和力，在這兩方面OT3肽不如一般的抗體，因此第二種策略也失敗了。通過第三種策略，我們成功鑒定了三個(gè)TCRγδ識(shí)別的腫瘤相關(guān)抗原，它們是丙酮酸激酶3，人mutS同源蛋白2(hMSH2)和熱休克蛋白(HSP)60。由于已有報(bào)道HSP60能被TCRγδ所識(shí)別，故鑒定出HSP60表明我們的策略是可行的。而丙

7、酮酸激酶3以及與DNA損傷修復(fù)有關(guān)的hMSH2可能是TCRγδ識(shí)別的新的蛋白抗原。 本研究就hMSH2是否為TCRγδ配體這一問題進(jìn)行了驗(yàn)證。RT-PCR結(jié)果顯示，在卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中，hMSH2 cDNA存在散在分布的點(diǎn)突變。SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測(cè)到分泌形式的hMSH2。用Western blotting在SKOV3細(xì)胞總蛋白中還發(fā)現(xiàn)一個(gè)60kD的hMSH2的缺失突變表達(dá)形式。而且，在包括SKOV3細(xì)胞在內(nèi)的很多腫

8、瘤細(xì)胞系細(xì)胞膜上均檢測(cè)到hMSH2的表達(dá)。免疫組化結(jié)果證明，腫瘤組織中也有異位表達(dá)的hMSH2。另外，Vδ2 γδT細(xì)胞對(duì)SKOV3細(xì)胞的細(xì)胞毒活性也能被抗hMSH2抗體部分封閉。 同時(shí)，本研究還構(gòu)建和表達(dá)了五種重組的hMSH2蛋白，包括hMSH2全長(zhǎng)蛋白，分別含hMSH2 N端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域和C端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白片段，以及SKOV3細(xì)胞表達(dá)的含有散在突變的兩個(gè)分段蛋白。所有的這五個(gè)蛋白都能特異性與Vδ2γδT細(xì)胞結(jié)合，并刺激其活化

9、增殖，分泌γ干擾素，并且促進(jìn)Vδ2γδT細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性。此外，本研究還利用昆蟲病毒表達(dá)系統(tǒng)，得到了比原核大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)更具生物活性的hMSH2蛋白，這為hMSH2蛋白進(jìn)一步結(jié)構(gòu)與功能研究奠定了基礎(chǔ)。 綜上所述，本研究取得了以下學(xué)術(shù)成果： l、證明了CDR3δ在決定TCRγδ識(shí)別抗原特異性上的關(guān)鍵作用，TCRγδ識(shí)別抗原時(shí)僅僅依賴CDR3δ一級(jí)結(jié)構(gòu)的特異性，因此人工合成的CDR3δ肽OT3是尋找TCRγδ抗原的很

10、奏效的探針； 2、建立了一個(gè)采用基于CDR3δ肽結(jié)合特性的免疫.生物化學(xué)技術(shù)策略鑒定TCRγδ所識(shí)別的蛋白抗原的新的有效的方法； 3、首次發(fā)現(xiàn)在癌變的情況下，異位表達(dá)的hMSH2很可能是一個(gè)新的Vδ2γδT細(xì)胞所識(shí)別的腫瘤配體分子，其生物學(xué)意義在于對(duì)固有免疫系統(tǒng)的預(yù)警作用； 4、證明了昆蟲病毒表達(dá)系統(tǒng)是一個(gè)穩(wěn)定而有效的真核表達(dá)系統(tǒng)，在昆蟲細(xì)胞中能完成很多翻譯后的修飾，在使表達(dá)的外源蛋白保有天然蛋白的生物學(xué)活性上至