生物化學(xué)-酶

1、第五章 酶 學(xué),,酶就是由細(xì)胞合成的，在機(jī)體內(nèi)行使催化功能的生物催化劑。,沒(méi)有酶的反應(yīng),有酶催化的反應(yīng),第一節(jié) 酶的概念及其化學(xué)本質(zhì),酶的化學(xué)本質(zhì),主要是蛋白質(zhì)，極少數(shù)是RNA（核酶）。,All enzymes are proteins except some RNAs and not all proteins are enzymes,第二節(jié) 酶作用特點(diǎn),絕對(duì)特異性（脲酶）相對(duì)特異性（磷酸酶）立體異構(gòu)特異性 （D-

2、氨基酸氧化酶）,高度的催化效率,高度的特異性,酶活力可調(diào)節(jié)性,,酶促反應(yīng)的特點(diǎn),,一、酶的高效催化性,二、酶的高度專一性,,二、酶的高度專一性,,,1.絕對(duì)專一性,2、相對(duì)專一特性,棉子糖,,,,3、立體異構(gòu)專一性,三、酶促反應(yīng)的溫和性與對(duì)反應(yīng)條件的高度敏感性,酶的活性是受嚴(yán)格控制的,酶促反應(yīng)一般在pH 5-8 水溶液中進(jìn)行，反應(yīng)溫度范圍為20-40°C。高溫或其它苛刻的物理或化學(xué)條件，將引起酶的失活。,四、酶活性的可調(diào)節(jié)

3、性,,如抑制劑調(diào)節(jié)、共價(jià)修飾調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)、酶原激活及激素控制等。,根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可將酶分為三類：?jiǎn)误w酶：僅有一條多肽鏈組成的酶。 寡聚酶：有幾個(gè)甚至幾十個(gè)亞基組成的酶。 多酶復(fù)合體：由功能相關(guān)的一組酶在空間相互嵌合的復(fù)合體。,第三節(jié) 酶的分類與命名,一 、酶的化學(xué)組成與分類,多酶復(fù)合體,一 、酶的化學(xué)組成與分類,（一）單純蛋白酶: 酶本身就是蛋白質(zhì)，沒(méi)有其它成分。,酶按其

4、分子組成分為單純酶和結(jié)合酶兩類：,（二）結(jié)合酶,由蛋白質(zhì)和非蛋白部分組成的酶。 非蛋白部分一般是有機(jī)小分子化合物或金屬離子，稱為輔因子（輔酶或輔基）。缺少輔因子，酶的催化作用就會(huì)消失。P106表,酶,結(jié)合酶,,酶蛋白作用：,輔酶或輔基的作用： 起傳遞電子、原子和某些基團(tuán)的作用 即決定反應(yīng)的類型,決定催化反應(yīng)的特異性,輔助因子,金屬離子作用：,1.活性中心的組成成分；2.連接酶與底物的

5、橋梁；3.維持酶的構(gòu)象,,,結(jié)合酶各部分的作用,1.氧化還原酶類（oxidoreductase): 催化氧化還原反應(yīng)： A·2H + B → A + B· 可分為 需氧脫氫酶、氧化酶和不需氧脫氫酶。2.轉(zhuǎn)移酶類(transferanses)： 催化底物功能基團(tuán)之間的轉(zhuǎn)移反應(yīng)： AB + C ←→A + B

6、C3.水解酶類(hydrolases): 催化底物進(jìn)行水解反應(yīng): AB + HOH →AOH + BH,二、 國(guó)際系統(tǒng)分類法,4.裂合酶類(lyases)： 催化底物裂解反應(yīng)，并產(chǎn)生雙鍵， 或其逆反應(yīng)，將一個(gè)基團(tuán)加到雙鍵上： A·B ←→ A + B5.異構(gòu)酶類(isomerases)：

7、 催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)變： A ←→ B 如異構(gòu)酶和消旋酶催化的反應(yīng)。6.合成酶(連接酶)類(ligases)： 這類酶催化一切必須與ATP分解相聯(lián)， 并由二種物質(zhì)合成一種物質(zhì)的反應(yīng)： A + B + ATP → A·B + ADP + Pi(或 AMP + PPi)

8、 例如谷氨酰胺合成酶催化的反應(yīng).,乳酸脫氫酶（EC.1.1.1.27）,除上述6類酶依次編號(hào)外，根據(jù)酶催化的化學(xué)鍵特點(diǎn)和參加反應(yīng)基團(tuán)不同，將每一類分成亞類和亞亞類。每個(gè)酶分類由4個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字組成，數(shù)字前冠以EC（eneyme commission),,命名原則如下－－（ 1）根據(jù)酶的底物命名。如蛋白酶、脂肪酶（2）根據(jù)所催化的反應(yīng)的性質(zhì)命名。如水解酶、氧化酶（3）有的酶結(jié)合上述兩個(gè)原則命名。例如：乙醇脫氫酶（4）在這些基礎(chǔ)上有

9、時(shí)還加上酶的來(lái)源或酶的其它特點(diǎn)。 如木瓜蛋白酶、蛇毒磷酸二酯酶,三 酶的命名,（一）習(xí)慣命名法,,要求能確切表明底物的化學(xué)本質(zhì)及酶的性質(zhì)，包括兩部分，即底物名稱及反應(yīng)類型，底物間用“ ：”分開(kāi)，若底物之一是水則可略去不寫。,ATP+CH3COOH ADP+CH3C,,,,,O,~,,P,其系統(tǒng)名為：ATP：乙酸磷酸轉(zhuǎn)移酶,（二）國(guó)際系統(tǒng)命名法,第四節(jié) 酶的作用機(jī)理,研究酶的催化

10、機(jī)理，主要是為了說(shuō)明酶是如何快速完成催化反應(yīng)的，為什么能專一性地選擇底物，如何高效率地實(shí)現(xiàn)斷鍵和成鍵催化過(guò)程的，以便在生產(chǎn)實(shí)踐中合理運(yùn)用。,,在一個(gè)化學(xué)反應(yīng)體系中，只有處于活化態(tài)的分子才能在分子碰撞中發(fā)生反應(yīng)。 反應(yīng)物中活化分子越多，則反應(yīng)速率越快。 活化分子具有的能量稱為活化能。 分子從常態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿菀装l(fā)生化學(xué)反應(yīng)的活躍狀態(tài)所需要的能量稱為活化能。 物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)所需要活化能越高，則表明該物質(zhì)越穩(wěn)定。而酶作

11、為催化劑能降低參加反應(yīng)物質(zhì)的活化能，因而酶促反應(yīng)具有了高效性。,那些因素促成酶具有高的催化效率？,一、酶的催化作用與分子活化能,,酶可降低所催化反應(yīng)的活化能,,,,S,P,ES,EST,EP,ST,,反應(yīng)能量變化,無(wú)酶時(shí)所需能量,有酶時(shí)所需能量,差別在那里？,T = Transition state,二、中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō),使分子變?yōu)榛罨肿拥耐緩接卸€(gè)：(1)對(duì)反應(yīng)體系加熱或用光照射。（2）改變反應(yīng)途徑,降低反應(yīng)能閾，使反應(yīng)沿著一個(gè)活化

12、能閾較低的途徑進(jìn)行。,1.酶促反應(yīng)改變反應(yīng)途徑,目前比較圓滿的解釋是中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)。 即酶在催化反應(yīng)時(shí)，首先與底物結(jié)合形成一個(gè)不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物ES。然后ES再分解為產(chǎn)物和原來(lái)的酶： E+S?ES→E+P 當(dāng)?shù)孜锖兔富パa(bǔ)結(jié)合形成過(guò)渡態(tài)中間復(fù)合物時(shí)，釋放出一部分結(jié)合能，使 ES 比 E 和 S 單獨(dú)存在時(shí)能解較低，從而使整個(gè)反應(yīng)的活化能降低，加快了化學(xué)反應(yīng)速度。,酶如何使反應(yīng)的活化能降低？,催化反應(yīng)歷程,一般化學(xué)反應(yīng)歷

13、程： S P酶促反應(yīng)歷程： S + E ES E + P,,,,,,了解酶的活性中心，有助于了解中間產(chǎn)物的形成,三、酶的活性中心,酶的活性中心——酶分子表面與底物結(jié)合并將底 物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的空間結(jié)構(gòu)區(qū)域。 活性中心包括結(jié)合基團(tuán)和催化基團(tuán)。 結(jié)合部位決定酶的專一

14、性， 催化部位決定酶所催化反應(yīng)的性質(zhì)。,必需基團(tuán)——酶分子中與酶活性相關(guān)的基團(tuán) （羥基、巰基、咪唑基和羧基）。活性中心內(nèi)必需基團(tuán)——結(jié)合和催化活性中心外必需基團(tuán)——維持酶構(gòu)象,胰凝乳蛋白酶,活性中心的三個(gè)氨基酸殘基形成催化三聯(lián)體。,木瓜蛋白酶活性中心氨基酸殘基,胰蛋白酶主鏈在空間的走向及活性中心,胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶,胰凝乳蛋白酶與底物類似物復(fù)合物的結(jié)晶學(xué)研究說(shuō)明了專一性識(shí)別部位的位置以及敏

15、感肽鍵的可能取向,活性中心的主要特征,（1）活性中心是一個(gè)三維實(shí)體，通常由在一級(jí)結(jié)構(gòu)上并不 相鄰的氨基酸殘基組成（2）活性中心只占酶總體積很小的一部分（約1％～2%）（3）活性中心為酶分子表面的一個(gè)裂縫、空隙或口袋，中 心內(nèi)多為疏水氨基酸殘基，但也有少量極性氨基酸殘 基，以便底物結(jié)合和進(jìn)行催化。（4）與底物結(jié)合為多重次級(jí)鍵，包括氫鍵、疏水鍵和范德 華力；（5）底物結(jié)合的特異性在一定程度上

16、取決于活性中心和底 物之間在結(jié)構(gòu)上的互補(bǔ)性；（6）活性中心的構(gòu)象不是固定不變的，而是具有一定的柔 性。,四、誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō),,解釋酶專一性的幾種模型：（1）鎖與鑰匙學(xué)說(shuō)（2）誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō),為了闡明酶的催化機(jī)理，人們?cè)诖罅繉?shí)驗(yàn)工作的基礎(chǔ)上，從不同角度提出了種種假設(shè)。,但酶的多底物現(xiàn)象，酶促反應(yīng)的催化，及酶促反應(yīng)的相對(duì)專一性都無(wú)法用這一假說(shuō)解釋。,鎖鑰假說(shuō):認(rèn)為整個(gè)酶分子的天然構(gòu)象是具有剛性結(jié)構(gòu)的，酶表面具有特

17、定的形狀。酶與底物的結(jié)合如同一把鑰匙對(duì)一把鎖一樣。,酶與底物結(jié)合的“鎖與鑰匙”模型,酶與底物結(jié)合的“誘導(dǎo)契合”模型,誘導(dǎo)契合假說(shuō)： 酶的活性中心具有一定的柔性，當(dāng)?shù)孜锱c酶相遇時(shí)，可誘導(dǎo)酶活性中心的構(gòu)象發(fā)生相應(yīng)的改變，使活性中心上有關(guān)基團(tuán)達(dá)到正確的排列和定向，因而使酶和底物契合而結(jié)合成中間絡(luò)合物，并引起底物發(fā)生反應(yīng)。,酶與底物結(jié)合的“誘導(dǎo)契合”的要點(diǎn),己糖激酶的誘導(dǎo)契合,誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)比較合理地解釋了酶促反應(yīng)的 專一性，又

18、為解釋酶促反應(yīng)高效性奠定了基礎(chǔ)。 其理論要點(diǎn)是，酶與底物誘導(dǎo)互變，功能基團(tuán)與反應(yīng)部位定向排布，達(dá)到互補(bǔ)契合，然后發(fā)生反應(yīng)。,中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō),E + S =ES---E+P,五、 使酶具有高催化效率的因素,（一）鄰近效應(yīng)（proximity effect）和定向效應(yīng)（orientation effect）,在酶促反應(yīng)中，由于酶和底物分子之間的親和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趨勢(shì)，最終結(jié)合到酶的活性中心，使底物在酶活性中

19、心的有效濃度大大增加的效應(yīng)叫做鄰近效應(yīng)。定向效應(yīng)：當(dāng)專一性底物向酶活性中心靠近時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)酶分子構(gòu)象發(fā)生改變，使酶活性中心的相關(guān)基團(tuán)和底物的反應(yīng)基團(tuán)正確定向排列，同時(shí)使反應(yīng)基團(tuán)之間的分子軌道以正確方向嚴(yán)格定位，使酶促反應(yīng)易于進(jìn)行。以上兩種效應(yīng)使酶具有高效率和專一性特點(diǎn)。,化學(xué)反應(yīng)的速度取決于反應(yīng)物分子的有效碰撞。處在溶液中的反應(yīng)物分子只有通過(guò)彼此擴(kuò)散相遇才有可能發(fā)生反應(yīng)。 在生理?xiàng)l件下，一個(gè)典型的溶質(zhì)分子和酶分子活性部位結(jié)合的頻

20、率大約是108～109 mol·L-1·S-1。如果反應(yīng)物之間有靜電吸引，相遇的頻率可能是很高的．在反應(yīng)中。僅有靠近還不夠，還需要反應(yīng)的基團(tuán)彼此相互嚴(yán)格的定向。只有既靠近又定向，反應(yīng)分子才被作用迅速形成過(guò)渡態(tài)（如下圖所示）。,,,,,,,,,,,,,,,,A.反應(yīng)物的反應(yīng)基團(tuán) 和催化基團(tuán)既不靠 近，也不彼此定向,B.兩個(gè)基團(tuán)靠近，但不 定向，也不利于反應(yīng),C.兩個(gè)基團(tuán)既靠近，又 定向，大大有

21、利于底 物形成過(guò)渡態(tài)，加速 反應(yīng),鄰近與定向（軌道定向）效應(yīng)的示意圖,鄰近效應(yīng)需要底物分子同酶弱的結(jié)合，即這種結(jié)合是低親和力的。實(shí)驗(yàn)表明，鄰近效應(yīng)對(duì)酶促反應(yīng)的貢獻(xiàn)使反應(yīng)的效率提高104～105。,酶-底復(fù)合物形成時(shí)，酶分子構(gòu)象發(fā)生變化，底物分子也常常受到酶的作用而發(fā)生變化，甚至使底物分子發(fā)生扭曲變形，從而使底物分子某些鍵的鍵能減弱，產(chǎn)生鍵扭曲，有助于過(guò)度態(tài)的中間產(chǎn)物形成,從而降低了反應(yīng)的活化能。 底物

22、結(jié)合可以誘導(dǎo)酶分子構(gòu)象的變化，而變化的酶分子又可使底物分子的敏感鍵產(chǎn)生“張力”，甚至“形變”，從而促進(jìn)酶-底物中間產(chǎn)物進(jìn)入過(guò)渡態(tài)。這實(shí)際上是酶與底物誘導(dǎo)契合的一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程。羧肽酶A的X-衍射分析結(jié)果證明了“電子張力”的存在。 酶催化的張力與變形效率的貢獻(xiàn)至少提高104～5,（二）底物分子變形或扭曲,,,,,,,,,,,底物分子發(fā)生變形,底物分子和酶分子都發(fā)生變形,底物和酶結(jié)合時(shí)的構(gòu)象變化示意圖,這里指廣義的酸堿催化，即質(zhì)子供體及

23、質(zhì)子受體的催化。 發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的許多反應(yīng)類型是受廣義的酸堿催化的，達(dá)到降低反應(yīng)活化能的過(guò)程。 酶活性部位上的某些基團(tuán)（如氨基、羧基、硫氫基、酚羥基及咪唑基等）可以作為良好的質(zhì)子供體或受體對(duì)底物進(jìn)行酸堿催化。 如His 殘基的咪唑基是酶的酸堿催化作用中最活潑的一個(gè)催化功能團(tuán)。,廣義酸基團(tuán) 廣義堿基團(tuán) （質(zhì)子供體）

24、 （質(zhì)子受體）,（三）酸堿催化,影響酸堿催化反應(yīng)速度的因素有兩個(gè)。1）酸堿的強(qiáng)度： 在這些功能基中，組氨酸咪唑基的解離常數(shù)是6.0，這意味著咪唑基上解離下來(lái)的質(zhì)子的濃度與水中的[H+]相近，因此它在接近于中性條件下有一半以酸形式存在，另一半以堿形式存在。也就是說(shuō)咪唑基既可以作為質(zhì)子供體，又可作為質(zhì)子受體在酶反應(yīng)中發(fā)揮催化作用。因此，咪唑基是催化中最有效且最活潑的一個(gè)催化功能基；2）功能基供出質(zhì)子和

25、接受質(zhì)子的速度： 在這方面，咪唑基又是特別突出，它供出或接受質(zhì)子的速度十分迅速，其半壽期小于10-10秒。而且供出和接受質(zhì)子的速度幾乎相等。,廣義的酸堿催化具有它的獨(dú)到之處，因?yàn)樵诩?xì)胞中接近中性PH的條件下，H+及OH-的濃度太低，不足以起到催化劑的作用。 例如牛胰核糖核酸酶及牛凝乳蛋白酶等都是通過(guò)廣義的酸堿催化而提高酶反應(yīng)速度的。,許多生物化學(xué)上的反應(yīng)易遭受到廣義的酸-堿催化。具有酸-堿催化能力的酶對(duì)溶

26、液pH非常敏感，因?yàn)閜H影響酶活性部位的側(cè)鏈質(zhì)子化狀態(tài)。 廣義的酸或堿催化可使反應(yīng)速度提高10～100倍。,催化劑通過(guò)與底物形成反應(yīng)活性很高的共價(jià)過(guò)渡產(chǎn)物，使反應(yīng)活化能降低，從而提高反應(yīng)速度的過(guò)程，稱為共價(jià)催化。。酶中參與共價(jià)催化的基團(tuán)主要包括以下親核基團(tuán)： His 的咪唑基，Cys 的巰基，Asp 的羧基，Ser 的羥基等；親電子基團(tuán)：H+ 、Mg2+、 Mn2+ 、Fe3+某些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以參與

27、共價(jià)催化作用。,（四） 共價(jià)催化,生物學(xué)上重要的親核劑 是帶負(fù)電荷的基團(tuán)或含有容易與缺電子基團(tuán)形成共價(jià)鍵的未共用的電子對(duì)。生物學(xué)上重要的親電劑： 是那些帶正電荷的、含未飽和的價(jià)電子層的﹑或具電負(fù)性的原子。,共價(jià)催化在酶的催化反應(yīng)中占據(jù)十分突出的位置，對(duì)酶促反應(yīng)速度的加速貢獻(xiàn)大約是100倍。,許多氧化-還原酶中都含有銅或鐵離子，它們作為酶的輔助因子起著傳遞電子的功能。 許多激酶的底物為ATP-Mg

28、2+復(fù)合物。 金屬離子通過(guò)水的離子化促進(jìn)親核催化。,（五）金屬離子催化,（六）酶活性部位微環(huán)境的影響,結(jié)合區(qū)可避免水分子干擾,在避開(kāi)水分子的干擾下，分子間的離子鍵才容易產(chǎn)生。,,,-,+,（七） 多元催化作用,酶的活性中心部位，一般都含有多個(gè)起催化作用的基團(tuán)，這些基團(tuán)在空間有特殊的排列和取向，可以對(duì)底物價(jià)鍵的形變和極化及調(diào)整底物基團(tuán)的位置等起到協(xié)同作用，從而使底物達(dá)到最佳反應(yīng)狀態(tài)。 同時(shí)幾個(gè)基元催化反應(yīng)協(xié)同作用，例如胰凝

29、乳蛋白酶的“電荷中繼網(wǎng)”等。 不同的酶，起作用的因素可能是不同的，可以受一種或多種因素的影響。,,第五節(jié) 酶活力及其測(cè)定,一、 酶活力及其測(cè)定,酶活力： 是酶促反應(yīng)的能力。 酶活力大小是指在一定條件所催化的某一化學(xué)反應(yīng)速度的快慢，即酶催化的反應(yīng)速度越快，酶活力越高；反之則表示該酶活力低。,如何測(cè)定酶活力？,以產(chǎn)物濃度對(duì)反應(yīng)時(shí)間作圖，可得到酶促反應(yīng)速度曲線,注意：初速度的測(cè)定是關(guān)鍵，為什么？,pH、溫度、離子強(qiáng)

30、度和反應(yīng)產(chǎn)物都會(huì)影響酶促反應(yīng)體系的穩(wěn)定,原 因底物濃度的降低、產(chǎn)物的增加造成的逆反應(yīng)的加快產(chǎn)物的抑制作用酶本身逐漸失活,可見(jiàn)，反應(yīng)速度只在最初一段時(shí)間內(nèi)保持恒定，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)速度逐漸下降,酶活性測(cè)定，應(yīng)測(cè)定酶促反應(yīng)的初速度,（一）酶活力單位 ： 指在特定條件下，酶促反應(yīng)在單位時(shí)間內(nèi)生成一定量的產(chǎn)物或消耗一定量底物所需要的酶量。 依據(jù)國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)規(guī)定：在標(biāo)準(zhǔn)條件(25℃、最適pH、最適

31、底物濃度)下，每分鐘轉(zhuǎn)化 1 mmol 底物的酶量，為1個(gè)酶活單位 (IU)。 這樣酶的含量就可以用每克酶制劑或每毫升酶制劑含有多少酶單位來(lái)表示（U/g或U/ml）。,二、酶催化效率的表示單位,比活力：每mg蛋白質(zhì)所含有的酶活力單位數(shù)。,比活力是酶制劑純度的常用指標(biāo).比較不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)同一種酶制劑優(yōu)劣時(shí)，以比活力表示。 比活力大，純度愈高。,（二） 酶的比活力,在酶的純

32、化過(guò)程中, 每步純化后都要測(cè)定酶的比活力, 例如, 某酶經(jīng)過(guò)四個(gè)純化步驟后, 獲得如下的數(shù)據(jù): 純化步驟： Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 總活力： 6 4 3 2 總蛋白： 20 10 5 2 比活力： 6/20 4/10 3/5 2/2 在提純中，總活性在減少，總蛋白也

33、在減少，但比活性在提高。 此外, 在酶的純化工作中還要計(jì)算兩個(gè)具有實(shí)際意義 的量, 即純化倍數(shù)和回收率(產(chǎn)量%)： 純化倍數(shù) = 每次比活力/第一次比活力 回收率（產(chǎn)量%）=(每次的總活力/第一次總活力)×100,1972年，為了使酶的活力單位與國(guó)際單位制中的反應(yīng)速度(mol/s)表達(dá)方式一致，推薦使用一種新的單位（酶的轉(zhuǎn)換數(shù)），既Katal, 1Kat為每秒能使1mol底物轉(zhuǎn)

34、化成產(chǎn)物的酶量。 1Kat＝6?107 IU 1 IU＝16.67×10-9 Kat 即1 IU=16.7 nKat 這種表示方法代表了酶催化底物轉(zhuǎn)化的效率。,（三）酶轉(zhuǎn)換數(shù) （Katal）,酶的轉(zhuǎn)換數(shù)：kcat值 kcat值以一定條件下每秒鐘每個(gè)酶分子轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)來(lái)表示酶的催化效率。,即在酶濃度一定時(shí)，底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶的濃度，既體系中的酶活性中心被底物飽和情況下，

35、酶對(duì)特定底物的最大催化速度（Vmax)，稱為轉(zhuǎn)換數(shù)（turnover number ），也稱為催化常數(shù)（Kat，Katal)。 米氏方程推導(dǎo)中的k3即為轉(zhuǎn)換數(shù)（ES→E+P，箭頭上以k3表示）。 當(dāng)?shù)孜餄舛冗^(guò)量時(shí)，因?yàn)閂max=k3[E0]，故此轉(zhuǎn)換數(shù)可用以下公式進(jìn)行計(jì)算： 　　轉(zhuǎn)換數(shù)=k3=Vmax/[E0],（四） 自定義的酶活力單位,這種單位簡(jiǎn)單方便，省去了許多計(jì)算；但只能進(jìn)行酶活力的相對(duì)比較。,基于某些酶測(cè)

36、定的難度，自定義酶活力單位。有的甚至直接用測(cè)得的物理量，如單位時(shí)間內(nèi)消光值的變化 (DA/t) 表示酶活力單位。,一、底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度影響在底物濃度低時(shí), 反應(yīng)速度與底物濃度成正比，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)特征。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值，幾乎所有的酶都與底物結(jié)合后，反應(yīng)速度達(dá)到最大值（Vmax），此時(shí)再增加底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)特征。。,第六節(jié)影響酶促反應(yīng)速度的因素,這種酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線可以用中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)解釋

37、 k1 k2 E + S ←→ ES → P + E k-1 一般以產(chǎn)物的生成速度代表整個(gè)酶催化反應(yīng)速度，而產(chǎn)物生成的速度取決于中間產(chǎn)物的濃度. 因此, 整個(gè)酶促反應(yīng)的速度取決于中間產(chǎn)物的濃度. 在酶促反應(yīng)初始，底物與酶的結(jié)合速度反應(yīng)了酶促反應(yīng)速度，但當(dāng)所有的酶與底物都結(jié)合后就達(dá)到最大反應(yīng)速度，此時(shí)再

38、增加底物濃度，表觀呈現(xiàn)的是一種酶與底物結(jié)合和解離的動(dòng)態(tài)平衡，最大反應(yīng)速度不會(huì)改變。,米氏方程1913年，德國(guó)化學(xué)家Michaelis和Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)對(duì)酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，推導(dǎo)出了表示整個(gè)反應(yīng)中底物濃度和反應(yīng)速度關(guān)系的著名公式，稱為米氏方程。,v —在不同[S]時(shí)的反應(yīng)速度Km — 米氏常數(shù)Vmax — 最大反應(yīng)速度[S] —底物濃度,,根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)，酶促反應(yīng)分兩步進(jìn)行:,(一）米氏方程的推導(dǎo)：,米氏方程表

39、明了當(dāng)已知Km 和Vmax 時(shí),底物濃度與反應(yīng)速度之間的關(guān)系.在底物濃度較低時(shí), Km≥[S],米氏方程分母中的[S]可忽略,既反應(yīng)速度與底物濃度成正比;為一級(jí)反應(yīng).在底物濃度很高時(shí), [S] ≥ Km, Km可忽略,此時(shí)V= Vmax,反應(yīng)速度與底物濃度無(wú)關(guān),為零級(jí)反應(yīng).,因此米氏方程是v對(duì)[s]為變量的典型雙曲線方程,（二）米氏常數(shù)（Km）的意義和應(yīng)用,當(dāng)v=1/2Vmax時(shí)：,1. Km的物理意義 ：

40、米氏常數(shù):反應(yīng)速度達(dá)到最大值一半時(shí)的底物濃度,單位為mol/L 。,,不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個(gè)重要特征物理常數(shù)。 Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測(cè)定的。不同條件下具有不同的Km值。,2.Km是酶的特征常數(shù)：,Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。 用于鑒別酶的最適底物。,3、Km可以表示酶與底物的親合程度：,4、當(dāng)Km

41、已知時(shí)，可求得任何底物濃度下酶活性中心被底物飽和的分?jǐn)?shù)(Fes)。,根據(jù)研究所需要的反應(yīng)程度，加入合適的底物濃 度。,Km 在實(shí)際工作中有以下應(yīng)用：,5、判斷可逆反應(yīng)的方向,催 化可逆反應(yīng)的酶，兩個(gè)方向的Km 是不同的。,6、了解底物在細(xì)胞內(nèi)的濃度，判斷酶活性是否受到抑制,7、判斷代謝中的限速步驟,8、判斷抑制劑類型,9、藥用酶的篩選應(yīng)用,測(cè)定Km和V的方法很多，最常用的是Lineweaver–Burk的作圖法 — 雙倒數(shù)作圖法。,

42、1 Km 1 1 ??? = ?? ? ??? + ?? V Vmax [S] Vmax,取米氏方程式的倒數(shù)形式：,1/Vmax,斜率=Km/Vmax,-1/Km,（四） 米氏常數(shù)Km的測(cè)定：,二、酶濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響,pH影響酶和底物的解離狀態(tài)，只有它們處于最佳解離狀態(tài)時(shí)，才容易形成中間產(chǎn)物，使反應(yīng)順利進(jìn)行。,三、pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響,四、溫度對(duì)酶促反應(yīng)速

43、度的影響,溫度對(duì)酶促反應(yīng)有兩種互相矛盾的影響： 一方面，酶促反應(yīng)和普通化學(xué)反應(yīng)相似，遵循溫度系數(shù)的一般規(guī)律； 另一方面，隨著溫度的升高，酶蛋白急劇變性，使酶迅速失活。這兩種因素綜合影響的結(jié)果，就出現(xiàn)了酶的最適溫度。,最適溫度,溫度系數(shù)（Q10）：在達(dá)到最適溫度之前，每提高10℃所增加的反應(yīng)速度的倍數(shù)。,五、激活劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響,激活劑——能使酶活性提高的物質(zhì)

44、 Mg2+－ATP對(duì)己糖激酶 Cl－對(duì)唾液淀粉酶,,,,巰基酶抑制劑,絲氨酸酶抑制劑,不可逆抑制,抑制作用,可逆性抑制,反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用,競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用,非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用,六.抑制劑對(duì)酶反應(yīng)的影響,抑制劑（inhibitor）——使酶活性降低而又不使酶變性的物質(zhì),（一）不可逆抑制作用,概念：抑制劑與酶活性中心必需基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，不能 用透析、超濾等物理方法將其除去恢復(fù)酶活性。常見(jiàn)抑

45、制劑：巰基酶抑制劑 絲氨酸酶抑制劑,巰基酶：以巰基（-SH）為必需基團(tuán)的酶 抑制劑：重金屬離子Ag+、Hg2+、砷劑等 解除重金屬離子中毒的常用物質(zhì)：二巰基丙醇,巰基酶的失活與復(fù)活, 2. 絲氨酸酶抑制劑,絲氨酸酶：以絲氨酸羥基(-OH)為必需基團(tuán)的酶 抑制劑：有機(jī)磷化合物 如膽堿酯酶抑制可用解磷定解除,膽堿酯酶的失活與復(fù)活,,乙酰膽堿 + H2O,膽堿 + 乙酸,膽堿酯酶,有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑,,,×,膽堿使神經(jīng)興

46、奮↑,,中毒,（肌肉震顫、瞳孔縮小、流涎、多汗、呼吸困難）,,有機(jī)磷農(nóng)藥的中毒機(jī)理：,概念：抑制劑與酶非共價(jià)結(jié)合，可用透析、 超濾等方法除去而恢復(fù)酶活性。類型：競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用,（二）可逆性抑制作用,1、競(jìng)爭(zhēng)性抑制,抑制劑與底物結(jié)構(gòu)相似，兩者競(jìng)爭(zhēng)與酶的活性中心結(jié)合，當(dāng)抑制劑與酶結(jié)合后，可以干擾酶與底物的結(jié)合，使酶的催化活性降低。,競(jìng)爭(zhēng)性抑制特點(diǎn)：,（1

47、）抑制劑與底物的結(jié)構(gòu)相似；（2）抑制劑與底物相互競(jìng)爭(zhēng)與酶活性中心結(jié)合；（3）抑制程度取決于[I]/ [S]相對(duì)比例；（4）增加底物濃度，可以減少或解除抑制作用；（5）Km值增大，Vm值不變 （6）動(dòng)力學(xué)曲線與米氏有別,6.動(dòng)力學(xué)曲線,,有競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑存在時(shí)，Km值增大(1+[I]/Ki)倍，且Km值隨[I]的增高而增大；最大反應(yīng)速度不變。,競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的速度方程：,,,競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用舉例：,1、丙二酸對(duì)琥珀酸脫氫酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑

48、制作用,2. 磺胺類藥物對(duì)二氫葉酸合成酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用,磺胺類藥物競(jìng)爭(zhēng)細(xì)菌的二氫葉酸合成酶，妨礙細(xì)菌合成二氫葉酸。二氫葉酸是細(xì)菌生存必需的，細(xì)菌又不能從環(huán)境中獲得，因此阻礙了二氫葉酸合成也就起到了抑菌作用，磺胺類藥主要作用是抑制細(xì)菌的繁殖，因有些細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)，需利用對(duì)氨基苯甲酸。,,磺胺類藥物的抑菌機(jī)理,（氨甲蝶呤）,蛋白質(zhì)←核酸,,2、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,（1）底物和抑制劑結(jié)構(gòu)不相似（2）底物和抑制劑可同時(shí)與酶的不同部位相結(jié)合（3）抑制

49、程度只取決于[I]（4）增加[S]不能去除抑制作用（5）Km值不變，Vmax值降低 （6）動(dòng)力學(xué)曲線變化,非競(jìng)爭(zhēng)性抑制特點(diǎn)：,4.米氏方程,有非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑存在時(shí)， Vmax減小(1+[I]/Ki)倍，且 Vmax值隨[I]的增高而降低；Km值不變。,6.動(dòng)力學(xué)曲線,,,這類抑制劑只可與ES復(fù)合物結(jié)合,不能與 E直接結(jié)合,主要抑制催化功能, 不影響底物結(jié)合位點(diǎn).,,3、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制,各種可逆性抑制作用的比較,第七節(jié) 調(diào)

50、 節(jié) 酶,變構(gòu)調(diào)節(jié)普遍存在于生物界,許多代謝途徑的關(guān)鍵酶都是利用變構(gòu)調(diào)節(jié)來(lái)控制代謝途徑之間的平衡.,,（一）變構(gòu)酶的作用性質(zhì) 有些酶的分子表面除了活性中心外，還具有重要的功能部位——調(diào)節(jié)中心 調(diào)節(jié)中心可以與小分子的代謝物相結(jié)合，使酶分子的構(gòu)象發(fā)生改變，從而影響酶的活性。這種作用叫變構(gòu)效應(yīng)(又叫別構(gòu)效應(yīng))； 具有變構(gòu)效應(yīng)的酶叫變構(gòu)酶，引起變構(gòu)的小分子物質(zhì)叫變構(gòu)劑(調(diào)節(jié)物)。,一、變構(gòu)酶,變構(gòu)酶的特點(diǎn)：,變

51、構(gòu)效應(yīng)： 當(dāng)代謝調(diào)節(jié)物結(jié)合在變構(gòu)中心上時(shí)，引起酶分子構(gòu)象的改變，使酶活性中心對(duì)底物的結(jié)合與催化作用受到影響，從而調(diào)節(jié)酶的反應(yīng)速度及代謝過(guò)程。,協(xié)同效應(yīng)也是變構(gòu)酶的一個(gè)特征：,當(dāng)變構(gòu)酶的一個(gè)亞基與其配體（底物或變構(gòu)劑）結(jié)合后，能夠改變相鄰亞基的構(gòu)象使其對(duì)配體的親和力發(fā)生改變的效應(yīng)稱為變構(gòu)酶的協(xié)同效應(yīng)。 如果對(duì)相鄰亞基的影響是導(dǎo)致其對(duì)配體的親和力增加，則稱為正協(xié)同效應(yīng)；反之，則稱為負(fù)協(xié)同效應(yīng)。 如

52、果是同種配體所產(chǎn)生的影響，則稱為同促協(xié)同效應(yīng)。如果是不同配體之間產(chǎn)生的影響則稱為異促協(xié)同效應(yīng)。,（二）變構(gòu)酶的動(dòng)力學(xué)特征及意義 變構(gòu)酶的 v-[S] 的關(guān)系不符合米氏方程，所以其曲線不是雙曲線型。,正協(xié)同效應(yīng)使酶的反應(yīng)速度對(duì)底物濃度的變化極為敏感；負(fù)協(xié)同效應(yīng)的酶在底物濃度較低的范圍內(nèi)活力上升較快，但隨著底物濃度增加到一定值后，反應(yīng)速度變化較小，表明該酶對(duì)高底物濃度存在的環(huán)境中，對(duì)底物濃度變化不敏感,米氏酶RS=8

53、1；正協(xié)同酶RS＜81；負(fù)協(xié)同酶RS ＞81,酶與底物結(jié)合達(dá)到0.9飽和度時(shí)的底物濃度 酶與底物結(jié)合達(dá)到0.1飽和度時(shí)的底物濃度,RS =,Koshland等提出下列公式區(qū)分三類酶,為了區(qū)分符合米氏方程的酶和正協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶及負(fù)協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶， Koshland建議用協(xié)同指數(shù)（cooperativity index，CI）來(lái)鑒別不同的協(xié)同作用以及協(xié)同的程度。 CI是指酶分子中的結(jié)合位點(diǎn)被底物飽和90%和飽和

54、10%時(shí)底物濃度的比值。故協(xié)同指數(shù)又稱飽和比值(Rs)。,,酶與底物結(jié)合達(dá)到0.9飽和度時(shí)的底物濃度 酶與底物結(jié)合達(dá)到0.1飽和度時(shí)的底物濃度,非調(diào)節(jié)酶：當(dāng)[S]=0.11時(shí)，v達(dá)到Vmax的10%；當(dāng)[S]=9時(shí)， v達(dá)到Vmax的90% ， RS =81而調(diào)節(jié)酶達(dá)到兩種同樣速度時(shí)[S]的比值為 RS =3,RS =,別構(gòu)酶動(dòng)力學(xué)曲線A.為非調(diào)節(jié)酶的曲線

55、 B.為別構(gòu)酶的S形曲線,變構(gòu)酶舉例：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶，簡(jiǎn)稱ATCase,降低與底物的親和力,不影響V MAX,異促,,CTP 是負(fù)調(diào)節(jié)劑；ATP是正調(diào)節(jié)劑,二、同工酶,能催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但酶的分子結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)不完全相同的一組酶。 同工酶一般都有兩個(gè)以上亞基組成。 已發(fā)現(xiàn)上百種同工酶，最有代表意義的是乳酸脫氫酶。,乳酸脫氫酶： 亞基：心肌型（H）；骨骼肌型（M） 五種：H

56、4; H3M; H2M2; HM3; M4 分布不同；當(dāng)發(fā)生病變時(shí)，同工酶譜發(fā)生變化。,乳酸,丙酮酸,,,天冬氨酸,天冬氨酰磷酸,,同功酶,,,,,,賴氨酸,蛋氨酸,蘇氨酸,,,,,,,,,,,,,,三、共價(jià)修飾調(diào)節(jié)酶,酶的共價(jià)修飾是指酶分子表面與某種化學(xué)基團(tuán)發(fā)生可逆的共價(jià)結(jié)合，改變某些功能基團(tuán)的性質(zhì)，從而改變酶催化活性的過(guò)程。 具有共價(jià)修飾的酶稱為共價(jià)調(diào)節(jié)酶。 包括磷酸化/去

57、磷酸化、乙?；?去乙?；?、甲基化/去甲基化等。 共價(jià)修飾調(diào)節(jié)具有快速和級(jí)聯(lián)放大效應(yīng),(三)酶原與酶原的激活,酶的概念及其化學(xué)性質(zhì)酶的作用特點(diǎn)酶的組成與分類酶的國(guó)際分類與命名酶的作用機(jī)理酶活力及其測(cè)定影響酶促反應(yīng)速度的因素酶活性的調(diào)節(jié)控制與調(diào)節(jié)酶,本章主要內(nèi)容,,,,如:胰蛋白酶原的激活過(guò)程: 胰蛋白酶原在腸激酶的作用下小，暴露活性中心,形成有活性的胰蛋白酶.,如：胰凝乳蛋

58、白酶原激活過(guò)程。,激活的關(guān)鍵是選擇性地切斷了Arg15和Ile16之間的肽鍵，使Ile16游離。在中性條件下，Ile16的α﹣NH3＋能和Asp194的β﹣COO－通過(guò)靜電作用形成離子鍵，有助于Ser195和His57之間以及His57和 Asp102之間通過(guò)氫鍵形成一個(gè)“電荷轉(zhuǎn)接系統(tǒng)”，使Ser195的側(cè)鏈具有更強(qiáng)的親核性，有利于和底物進(jìn)行作用，于是就表現(xiàn)出胰凝乳蛋白酶的完整的催化功能。 酶原的激活是生物體的一種調(diào)控方式，具有

59、重要的生理意義。,酶含量的調(diào)節(jié),酶含量的調(diào)節(jié)是指通過(guò)改變細(xì)胞中酶蛋白合成或降解的速度來(lái)調(diào)節(jié)酶分子的絕對(duì)含量，影響其催化活性，從而調(diào)節(jié)代謝反應(yīng)的速度。 酶含量的調(diào)節(jié)是機(jī)體內(nèi)遲緩調(diào)節(jié)的重要方式。,研究酶的醫(yī)學(xué)重要性,許多疾病是缺乏某一種酶或者一種酶不合適表達(dá)引起的。酶是許多藥物作用的目標(biāo)。酶有時(shí)可直接被用來(lái)治療某種疾病。存在一種酶或缺乏一種酶經(jīng)常被用來(lái)診斷某些疾病。 病毒性肝炎——谷丙轉(zhuǎn)氨酶 心肌梗塞——谷草轉(zhuǎn)氨酶、

60、肌酸激酶、LDH（H4） 急性胰腺炎——淀粉酶、脂肪酶,化學(xué)酶工程：也稱初級(jí)酶工程，主要是通過(guò)化學(xué)修飾、固定化處理、甚至通過(guò)化學(xué)合成等手段，改善酶的性質(zhì)以提高催化效率及降低成本。它包括自然酶、化學(xué)修飾酶、固定化酶及化學(xué)人工酶的研究和應(yīng)用?；瘜W(xué)修飾酶:對(duì)純酶進(jìn)行化學(xué)修飾以改善性能。常用于酶學(xué)研究和臨床醫(yī)學(xué)。固定化酶：指被結(jié)合到特定的支持物上并能發(fā)揮作用的一類酶。通過(guò)吸附、偶聯(lián)、交聯(lián)和包埋等物理和化學(xué)方法把酶做成仍具有酶活性的

61、水不溶性酶，裝入適當(dāng)容器形成反應(yīng)器。優(yōu)點(diǎn)：1.容易將酶與反應(yīng)體系分離；2.可反復(fù)使用；3.穩(wěn)定性好。 將固定化酶和固定化細(xì)胞應(yīng)用于化學(xué)工業(yè)的反應(yīng)系統(tǒng)稱為生物反應(yīng)器?；瘜W(xué)人工酶：模擬酶的生物功能，用化學(xué)半合成法（小分子化合物＋無(wú)活性蛋白）或全合成法（小分子有機(jī)物）合成的有催化活性的人工酶。生物酶工程：是從基因水平改造和設(shè)計(jì)新酶。包括三個(gè)方面：1.用DNA重組技術(shù)大量生產(chǎn)酶；2.對(duì)酶基因進(jìn)行修飾，生產(chǎn)遺傳修飾酶；3.設(shè)計(jì)新的

62、酶基因，合成自然界不曾有過(guò)的，性能穩(wěn)定、催化效率更高的新酶。,十一.酶工程簡(jiǎn)介,指在一定的生物反應(yīng)器中，利用酶的催化作用，將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化為有用物質(zhì)的技術(shù)，是將酶學(xué)理論與化工技術(shù)結(jié)合而形成的新技術(shù)。應(yīng)用領(lǐng)域：農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、環(huán)境保護(hù)、能源開(kāi)發(fā)等。,酶工程,十.酶的分離純化,選材,破碎細(xì)胞,抽提,分離、純化,進(jìn)一步純化,濃縮、制干,檢測(cè)酶純度,保存,,,,,,,,分離純化注意事項(xiàng)：,全部操作一般在0－5度間進(jìn)行。用有機(jī)溶劑時(shí)，必須在－